SYSTÉM PRACUJÍCÍ NA PRINCIPU DVOJROZMĚRNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE PROTEINŮ JAKO ALTERNATIVA K DVOJROZMĚRNÉ GELOVÉ ELEKTROFORÉZE

Význam tématu

Proteomika nabízí detailní pohled na změny proteinového složení buněk, který je klíčový pro pochopení mechanismu účinku protinádorových látek. Tradiční dvourozměrná gelová elektroforéza (2DE) sice poskytuje vysoké rozlišení, ale naráží na omezení při analýze hydrofobních, extrémně velkých nebo nabitých proteinů. Dvojrozměrná kapalinová chromatografie PF 2D (ProteomeLab™ PF 2D) představuje moderní alternativu, umožňující plně automatizovanou analýzu v kapalné fázi a lepší kompatibilitu s hmotnostní spektrometrií.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl využít systém PF 2D ke sledování proteomických změn v lidské lymfoblastické leukemii CEM po ošetření inhibitory cyklin-dependentních kinas boheminem. Výsledky jsou porovnány s daty získanými metodou 2DE, aby se hodnotila výkonnost a doplňkovost obou přístupů.

Použitá metodika a instrumentace

• Kultivace buněčné linie CEM v médiu RPMI 1640 s 10 % fetálního séra a 60 µM boheminu po dobu 12 h.
• Lyze buněk v pufru obsahujícím 6 M močovinu, 2 M thiomočovinu, 2 % oktylglukosidu, TCEP a koktejl proteázových inhibitorů.
• První rozměr: chromatofokusační kolona (pH 8,5→4,0) – 27 frakcí podle izoelektrického bodu.
• Druhý rozměr: reverzní fáze s neporézním silikagelovým režimem – separace podle hydrofobicity.
• Detekce UV absorbancí při 214 nm, sběr frakcí v 96jamkových destičkách.
• Trypsinová digestace, koncentrování SpeedVacem Savant DNA 110–230.
• Identifikace na MALDI-TOF spektrometru Bruker BIFLEX II s α-kyano-4-hydroxykyselinou jako matricí.
• Software: ProteoVue pro tvorbu 2D map, DeltaVue pro diferenciální analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

PF 2D umožnilo detekovat 1500–2300 proteinových píků, z nichž 24 vykazovalo více než dvojnásobnou změnu exprese po ošetření boheminem. Mezi sníženě exprimovanými proteiny dominovaly histony (H2B.a, H3.3, H2A.e, H4), adaptorové proteiny Crk-like a enzymy purinové biosyntézy. Naproti tomu mitochondriální Hsp60 vykázal zvýšenou expresi. Redukce histonů naznačuje změny chromatinu spojené s posttranslačními modifikacemi a ovlivnění transkripční aktivity, pokles Crk-like proteinů může souviset s narušením signalizace migrace a přežívání buněk.

Přínosy a praktické využití metody

PF 2D přináší plnou automatizaci, vyšší kapacitu naloženého proteinu a kontinuální kapalnou fázi, což zrychluje přípravu ke hmotnostní spektrometrii. Odstraňuje potřebu barvení gelů a umožňuje přímou kvantifikaci proteinů z UV absorbance.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s pokročilými MS technikami pro hloubkovou analýzu posttranslačních modifikací.
• Miniaturizace a zvýšení citlivosti pro analýzu vzácných vzorků a membránových proteinů.
• Objevování klinických biomarkerů a aplikace v personalizované medicíně.
• Vývoj softwaru pro automatickou anotaci a kvantitativní vyhodnocení proteomických dat.

Závěr

Systém PF 2D se ukázal jako vhodná komplementární metoda k 2DE při srovnávacích proteomických studiích. Automatizace, vyšší zatížitelnost vzorku a přímá kompatibilita s hmotnostní spektrometrií umožňují efektivně studovat mechanismy účinku protinádorových látek, jako je bohemin, a identifikovat potenciální biomarkery.

Reference

1. Sausville E. A., Johnson J., Alley M., Zaharevitz D., Senderowicz A. M.: Ann. N.Y. Acad. Sci. 910, 207 (2000).
2. Veselý J., Havlíček L., Strnad M., Blow J. J., Donella-Deana A., Pinna L., Letham D. S., Kato J., Detivaud L., Leclerc S.: Eur. J. Biochem. 224, 771 (1994).
3. Hajduch M., Havlíček L., Veselý J., Novotný R., Mihal V., Strnad M.: Adv. Exp. Med. Biol. 457, 341 (1999).
4. Patterson S. D.: Current Proteomics 1, 3 (2004).
5. Patterson S. D., Aebersold R. H.: Nature Genetics Suppl. 33, 311 (2003).
6. Kovářová H., Hajduch M., Kořínková G., Halada P., Krupičková S., Gouldsworthy A., Zhelev N., Strnad M.: Electrophoresis 21, 3757 (2000).
7. Kovářová H., Halada P., Man P., Dzubak P., Hajduch M.: Technol. Cancer Res. Treat. 1, 247 (2002).
8. Nowak S. J., Corces V. G.: Trends Genet. 20, 214 (2004).
9. Feller S. M., Posern G., Voss J., Kardinal C., Sakkab D., Zheng J., Knudsen B. S.: J. Cell Physiol. 177, 535 (1998).
10. Miller C. T., Chen G., Gharib T. G., Wang H., Thomas D. G., Misek D. E., Giordano T. J., Yee J., Orringer M. B., Hanash S. M., Beer D. G.: Oncogene 22, 7950 (2003).
11. Chodniewicz D., Klemke R. L.: Biochim. Biophys. Acta 1692, 63 (2004).