COMPREHENSIVE AAV CHARACTERIZATIONS USING HRMS: CAPSID PROTEINS, EMPTY/FULL CAPSID RATIO AND, SSDNA ANALYSIS

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) jsou klíčové vektorové systémy v genové terapii. Kvalitní charakterizace jejich kapsidových proteinů a genomové náplně je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem článku je představit integrovaný analytický přístup pomocí vysoce výkonné hmotnostní spektrometrie pro komplexní profilování AAV, zahrnující:

• Analýzu intact proteinů VP1, VP2 a VP3 u různých serotypů
• Stanovení poměru prázdné vs. plné kapsidy
• Izolaci a charakterizaci jednoreťazcové DNA uvnitř kapsid

Použitá metodika a instrumentace

Metodologický postup kombinuje několik technik:

• UPLC-TOF-MS pro stanovení přesných hmotností intact proteinů a peptidů
• Enzymatická digesce trypsinem a peptidové mapování RPLC-MS
• Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS) pro kvantifikaci poměru prázdné/plné kapsidy
• Anionová výměnná chromatografie (AEC) a velikostní exkluze (SEC) jako ortogonální metody rozlišení prázdných a plných částic
• Proteinase K digest a frakcionace ssDNA na Protein-Pak sloupci

Použité přístroje a software:

• Waters BioAccord LC-MS systém, ACQUITY UPLC H-Class, QTof
• Charge Detection Mass Spectrometer (MegaDalton Solutions)
• Kolony: ACQUITY BEH C4/C18, BEH SEC Guard, Protein-Pak Hi Res Q
• Softwary UNIFI 1.9.4 a Empower 3.0

Hlavní výsledky a diskuse

• Stanovení molekulových hmot VP1–VP3 u AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8 a AAV9 s přesností v řádu jednotek Da
• Peptidové mapování pro 98 % pokrytí sekvence VP1 a identifikaci PTM (deamidace, oxidace)
• Vynikající shoda mezi CDMS, AEC a SEC při stanovení procenta prázdných a plných kapsid
• Úspěšná izolace ssDNA, detekce fragmentů a dimeru dsDNA podle očekávaných hmotností (~0,9 MDa)

Přínosy a praktické využití metody

Tento integrovaný workflow umožňuje:

• Spolehlivou kontrolu kvality výrobních šarží AAV ve farmaceutickém průmyslu
• Rychlé rozlišení prázdných a plných částic, klíčových pro dávkování a bezpečnost
• Detailní mapování PTM a integrity kapsidových proteinů
• Analýzu genomové náplně včetně detekce degradace DNA

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace datové analýzy a využití umělé inteligence pro interpretaci hmotnostních spekter
• Rozšíření metodiky na další virové vektory a komplexní biologické přípravky
• Vývoj nových sloupců a ionizačních technik pro lepší rozlišení PTM
• Integrace CDMS s dalšími hyphenovanými postupy pro komplexnější antropologie virových částic

Závěr

Předložený přístup založený na kombinaci HRMS technik poskytuje robustní, citlivé a komplexní analýzy AAV kapsid a genomu. Workflow je vhodný pro rutinní QC i výzkumné aplikace, čímž podporuje vývoj bezpečných a účinných genových terapií.

Reference

1. J. Mol. Biol. 2016, 428(2):292–300. doi:10.1016/j.jmb.2015.06.019
2. Optimized reversed phase LC/MS methods for intact protein analysis and peptide mapping of adeno-associated virus proteins. Hum Gene Ther Methods 2021. doi:10.1089/hum.2021.046