PHARMSCI: Comprehensive AAV Characterizations Using HRMS: Peptide Mapping, Capsid Proteins, Intact ssDNA, and Intact Virus

Význam tématu

Gene therapies using adeno-associated viruses (AAV) představují perspektivní přístup v medicíně, avšak analytické standardy a regulatorní požadavky pro charakterizaci AAV přípravků stále nejsou dostatečně definovány. Přesná identifikace proteinových a nukleových komponent, stanovení poměru prázdných a plných kapsid a detekce posttranslačních modifikací je klíčová pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a reprodukovatelnosti léčiv. V praxi to znamená nutnost vyvinout metody, které zvládnou nízké koncentrace, malé vzorkové objemy a velké molární hmotnosti analyzovaných biologických makromolekul.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout komplexní analytické přístupy založené na vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrii (HRMS) pro detailní charakterizaci AAV v následujících oblastech:

• Peptidová mapování trypticky digerovaného AAV5
• Analýza intaktních kapsidových proteinů (různé serotypy AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9)
• Stanovení obsahu a integrity výměnitelné ssDNA izolované z AAV8 a AAV9
• Určení poměru prázdné/plné kapsidy pomocí ortogonálních metod (AEC, SEC, CDMS)

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinuje několik chromatografických a hmotnostně spektrometrických technik:

• Peptidová mapování
  
  • Denaturační SEC pro odstranění surfaktantů
  • Tryptická digest
  • UHPLC-TOF-MS s BEH C18 kolónou
• Analýza intaktních kapsidových proteinů
  
  • RPLC-MS s ACUITY BEH C4 kolónou
  • Intrinsic fluorescence (LC-FLR-MS) pro kvantifikaci jednotlivých VP1, VP2, VP3
• Analýza ssDNA a prázdné/plné kapsidy
  
  • Anion-Exchange Chromatography (AEC) s UV detekcí při 260 a 280 nm
  • Size Exclusion Chromatography (SEC) s UV detekcí
  • Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS) pro analýzu intaktních virionů

Klíčové přístroje:

• BioAccord LC-MS System (Waters)
• ACQUITY H-Class Bio (SEC a AEC)
• Charge-Detection Mass Spectrometry (MegaDalton Solutions)
• Informační software: UNIFI 1.9.4, Empower 3.0

Hlavní výsledky a diskuse

Peptidové mapování AAV5 dosáhlo 98 % pokrytí sekvence kapsidového proteinu VP1, identifikováno bylo několik posttranslačních modifikací (deamidace, oxidace) s relativním výskytem nad 0,5 %.
Poměry VP1, VP2 a VP3 byly přesně kvantifikovány u šesti serotypů, pozorované hmotnosti se shodovaly s teoretickými do rozdílu nižšího než 5 Da.
CDMS a chromatografické metody (AEC, SEC) ukázaly vysokou lineární korelaci při stanovení poměru prázdné/plné kapsidy, koeficient determinace R² > 0,995.
Analýza ssDNA z AAV9 potvrdila očekávanou molekulovou hmotnost ~0,9 MDa, po uvolnění z kapsidy dochází k částečné degradaci nebo bázování komplementárních řetězců.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinuté metody poskytují:

• Komplexní profil proteomu AAV na úrovni detailního peptidového i intaktního proteinového zkoumání
• Přesné stanovení molárního zastoupení kapsidových podjednotek
• Spolehlivé rozlišení prázdných a plně naložených virionů
• Možnost sledovat integritu a čistotu ssDNA

Metody jsou vhodné pro regulované laboratorní postupy při vývoji a kontrole kvality genové terapie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření CDMS pro rutinní kvantifikaci virových vektorů, integrace vysokorozlišovací MS s mikročipovými technologiemi a pokročilá bioinformatická řešení pro automatizované vyhodnocení dat. Dále bude klíčový vývoj miniaturizovaných a rychlých testů pro kontrolu kvality během výroby. Výhledově lze kombinovat virové charakterizace s klinickými biotesty pro komplexnější hodnocení bezpečnosti a účinnosti.

Závěr

Popsané HRMS-podpůrné přístupy představují robustní, spolehlivou a ortogonální sadu analytických nástrojů pro komplexní charakterizaci AAV genových vektorů. Přispívají k definování standardizovaných postupů a plní požadavky na přesnost, citlivost a specifitu nezbytné pro preklinické i klinické fáze vývoje.

Reference

1. J. Mol. Biol. 2016, 428(2 Pt A), 292–300. doi:10.1016/j.jmb.2015.06.019
2. Waters Corporation. Optimized reversed phase LC/MS methods for intact protein analysis and peptide mapping of adeno-associated virus (AAV) proteins. doi:10.1089/hum.2021.046