Analysis of siRNA Duplexes at Non- Denaturing UPLC Conditions Using MaxPeak Premier Column Technology

Význam tématu

Analýza siRNA duplexů v ne-denaturačních podmínkách je klíčová pro charakterizaci a kontrolu kvality moderních nukleotidových terapeutik. Umožňuje přesně oddělit a kvantifikovat intactní duplexy a nežádoucí jednovláknové oligonukleotidy, čímž přispívá k bezpečnosti a účinnosti léčiv. Technikou ne-denaturační UPLC se zachovává duplexová struktura, což je zásadní pro odhad přebytku jednovláknových komponent a optimalizaci procesu annealingu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit metodu iontově-párové reverzní fáze UPLC (IP-RP UPLC) s UV detekcí pro současnou separaci dvou siRNA duplexů a jejich jednovláknových nečistot za ne-denaturačních podmínek. Metoda byla navržena tak, aby zajistila vysokou selektivitu, opakovatelnost kvantifikace a minimalizaci ztrát vzorku způsobených adsorpcí na kovové povrchy.

Použitá metodika

• Příprava vzorků: reference a formulace siRNA duplexů v demineralizované vodě při koncentracích od 0,2 % do 130 % standardu.
• Mobilní fáze: A – 0,2 % hexylaminu a 0,5 % HFIP ve vodě; B – 80 % methanol/20 % acetonitril.
• Gradient: programovaný lineární gradient od nízkého podílu organické fáze k vyššímu, zajišťující rozdělení jednotlivých komponent.
• Podmínky: teplota kolony 20 °C, teplota autosamplera 10 °C, průtok 0,15 mL/min, detekce UV 260 nm, objem injekce 6 μL.

Použitá instrumentace

• UPLC systém: ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System s moduly QSM, CM-A, APH, FTN SM a PDA detektorem.
• Kolona: ACQUITY Premier Peptide BEH C18, 300 Å, 1,7 μm, 2,1 × 150 mm (MaxPeak Premier technologie).
• Software: Empower v3.0 pro integraci a kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• MaxPeak Premier kolona minimalizovala nespecifickou ztrátu siRNA a adsorpci na kovové povrchy, což vedlo k vynikající reprodukovatelnosti a lineárním kalibracím.
• Dva siRNA duplexy byly separovány s dostatečným rozlišením, přičemž se objevily i diastereomery způsobující multiplikované píky.
• Jednovláknové nečistoty byly dobře odděleny a kvantifikovány před hlavními duplexními vrcholy.
• Testy přenosu a carryover ukázaly minimální pozůstatky pod úrovní šumu, což potvrzuje spolehlivost kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje přesnou identifikaci a kvantifikaci jednotlivých siRNA duplexů a nečistot v léčivých formulacích.
• Metoda je vhodná pro QA/QC procesy i výzkum, zejména při optimalizaci annealingu a stanovení poměru duplex/jednovlákno.
• Kompatibilita mobilní fáze s MS umožňuje další potvrzení identit analytů podle molární hmotnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní analýzu modifikací a sekvenčních variant siRNA.
• Rozšíření aplikace na další nukleotidové terapie, včetně mRNA a antisense oligonukleotidů.
• Další vývoj materiálů kolony a povrchových úprav pro snížení interakcí a zvýšení citlivosti.
• Automatizace a vysokokapacitní screening různých sekvencí a formulací.

Závěr

Vyvinutá iontově-párová RP UPLC metoda s ACQUITY Premier Peptide BEH C18 kolonkou nabízí robustní, přesné a reprodukovatelné řešení pro analýzu siRNA duplexů za ne-denaturačních podmínek. Metoda splňuje požadavky na kvantitativní parametry, minimalizuje ztráty vzorku i carryover a je plně kompatibilní s MS detekcí.

Reference

• 1. Lundin KE, Gissberg O, Smith CIE. Oligonucleotide Therapies: The Past and Present. Hum Gene Ther. 2015;26:475–485.
• 2. Khvorova A, Watts JK. The Chemical Evolution of Oligonucleotide Therapies in Clinical Utility. Nat Biotechnol. 2017;35:238–248.
• 3. Suarez Marina I et al. Analysis of siRNA Drugs at Denaturing UPLC Conditions Using MaxPeak Premier Column Technology. Waters Application Note 720007362EN; 2021.
• 4. McCarthy SM, Gilar M, Gebler JC. Reversed-Phase Ion-Pair Liquid Chromatography Analysis and Purification of Small Interfering RNA. Anal Biochem. 2009;390:181–188.
• 5. DeLano M et al. Using Hybrid Organic−Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal Chem. 2021;93:5773–5781.
• 6. Gilar M, DeLano M, Gritti F. Mitigation of Analyte Loss on Metal Surfaces in Liquid Chromatography. J Chromatogr A. 2021;1650:462247.
• 7. Tuytten R et al. Stainless-Steel Electrospray Probe: A Dead End for Phosphorylated Organic Compounds? J Chromatogr A. 2006;1104:209–221.
• 8. Lauber MA et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper 720006930EN; 2021.
• 9. Walter TH et al. Faster Time to Results for UPLC Separations of Metal-Sensitive Analytes. Chromatography Today. 2021;Feb/Mar:40–44.
• 10. Stec WJ, Zon G, Uznanski B. RP-HPLC Separation of Diastereomeric Phosphorothioate Analogues. J Chromatogr. 1985;326:263–280.
• 11. Gilar M et al. Characterization of Therapeutic Oligonucleotides Using LC-MS Detection. Oligonucleotides. 2003;13:229–243.