Application NoteImproved Chromatographic Analysis of Oligonucleotides with ACQUITY PREMIER Oligonucleotide BEH C18 Columns

Význam tématu

Therapeutické oligonukleotidy představují inovativní léčiva pro antisense terapie, siRNA duplexy nebo mRNA vakcíny. Přesná chromatografická analýza je klíčová pro kontrolu kvality, kvantifikaci a reprodukovatelnost výsledků v oblasti lékového vývoje a klinických aplikací.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo identifikovat zdroje ztrát oligonukleotidů způsobené nespecifickou adsorpcí na kovových diagramech (frits) chromatografického hardware a ukázat přínos technologie MaxPeak HPS v ACQUITY PREMIER Oligonucleotide BEH C18 kolonkách pro zlepšení analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Analytické metody:

• Iontově párná reverzní fázová LC (IP RP LC) s mobilními fázemi obsahujícími alkylamoniové pufry (hexylammonium acetát, pH 6–8, teplota 60 °C).
• Metoda MISER (Multiple Injections in a Single Experimental Run) pro hodnocení adsorpce na fritu bez chromatografického sloupce.
• Gradientní separace 15–35 mer oligonukleotidů standardu MassPREP s acetonitrilem.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio
• PDA detektor 260 nm titanium 5 µL cell
• Empower 3.0 software
• ACQUITY PREMIER Oligonucleotide BEH C18 Column 1.7 µm 2.1×50 mm

Hlavní výsledky a diskuse

Experimenty potvrdily, že nerezový frit způsobuje až 29 % ztrátu oligonukleotidů při prvních vstupech. Adsorpce je intenzivnější v kyselém pH a klesá při vyšších pH hodnotách. Kondicionování kovových ploch opakovanými injekcemi vede k postupnému nasycení ale je přechodné, protože při praní mobile fází dochází k de-conditioning a uvolňování dříve vázaného analyzátu. Premiér hardware s MaxPeak HPS eliminuje adsorpci již od první injekce a udržuje téměř 100 % návratnost analyzátu v širokém pH rozmezí.

Přínosy a praktické využití metody

Technologie MaxPeak HPS zkracuje dobu a spotřebu kondicionačních injekcí, minimalizuje carryover a zvyšuje opakovatelnost analýz, což je zásadní pro vysoce citlivé LC-MS aplikace a rutinní QA/QC analytiku oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší uplatnění ochraných povrchových technologií HPS pro jiné analyzáty s afinitou k kovovým povrchům a jejich integrace do ultravysoce účinných separačních technik a velmi citlivých LC-MS metod pro stopovou analýzu.

Závěr

Nespecifická adsorpce oligonukleotidů na kovovém hardware je významným zdrojem chyb v kvantitativní analýze. Kondicionování poskytuje jen dočasnou ochranu. MaxPeak HPS Technologie v PREMIER sloupcích zcela eliminuje tyto ztráty a zlepšuje spolehlivost a opakovatelnost měření.

Reference

1. Gilar M Fountain KJ Budman Y Holyoke JL Davoudi H Gebler JC Characterization of Therapeutic Oligonucleotides using Liquid Chromatography with On-line Mass Spectrometry Detection Oligonucleotides 2003 13(4) 229–243
2. McCarthy SM Gilar M Gebler J Reversed-Phase Ion-pair Liquid Chromatography Analysis and Purification of Small Interfering RNA Anal Biochem 2009 390(2) 181–188
3. Basiri B Sutton JM Hooshfar S Byrnes CC Murphy MM Bartlett MG Direct Identification of Microribonucleic Acid miR-451 from Plasma using Liquid Chromatography Mass Spectrometry J Chromatogr A 2019 1584 97–105
4. Pardi N Hogan MJ Porter FW Weissman D mRNA Vaccines – A New Era in Vaccinology Nat Rev Drug Discov 2018 17(4) 261–279
5. Gilar M Bouvier ESP Purification of Crude DNA Oligonucleotides by Solid-Phase Extraction and Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography J Chromatogr A 2000 890(1) 167–177
6. Gilar M Analysis and Purification of Synthetic Oligonucleotides by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array and Mass Spectrometry Detection Anal Biochem 2001 298(2) 196–206
7. Gilar M Fountain KJ Budman Y Neue UD Yardley KR Rainville PD Russell II RJ Gebler JC Ion-pair Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography Analysis of Oligonucleotides Retention Prediction J Chromatogr A 2002 958(1-2) 167–182
8. Li N El Zahar NM Saad JG van der Hage ERE Bartlett MG Alkylamine Ion-Pairing Reagents and The Chromatographic Separation of Oligonucleotides J Chromatogr A 2018 1580 110–119
9. Gong L McCullagh JS Comparing Ion-Pairing Reagents and Sample Dissolution Solvents for Ion-Pairing Reversed-Phase Liquid Chromatography Electrospray Ionization Mass Spectrometry Analysis of Oligonucleotides Rapid Commun Mass Spectrom 2014 28(4) 339–350
10. Sturm M Quinten S Huber CG Kohlbacher O A Statistical Learning Approach to the Modeling of Chromatographic Retention of Oligonucleotides Incorporating Sequence and Secondary Structure Data Nucleic Acids Res 2007 35(12) 4195–4202
11. Gilar M Yang H Bouvier ES Warren B HPLC and UPLC Columns for the Analysis of Oligonucleotides Waters Application Note 720002376EN 2007
12. Wyndham KD OGara JE Walter TH Glose KH Lawrence NL Alden BA Izzo GS Hudalla CJ Iraneta PC Characterization and Evaluation of C18 HPLC Stationary Phases based on Ethyl-Bridged Hybrid Organic/Inorganic Particles Anal Chem 2003 75(24) 6781–6788
13. Ivleva VB UPLC-MS Analysis of Interfering RNA Oligonucleotides Waters Application Note 720002412EN 2008
14. Huber CG Oefner PJ Bonn GK High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers Anal Biochem 1993 212(2) 351–358
15. Huber CG Oefner PJ Preuss E Bonn GK High-Resolution Liquid Chromatography of DNA Fragments on Non-Porous Poly(Styr Divinylbenzene) Particles Nucleic Acids Res 1993 21(5) 1061–1066
16. McCarthy SM Gilar M Hexylammonium Acetate as an Ion-Pairing Agent for IP-RP LC Analysis of Oligonucleotides Waters Application Note 720003361EN 2010
17. Shlyankevich A Validation of Analytical Methods for Oligonucleotides Unique Challenges and Solutions TIDES 2010
18. Tuytten R Lemiere F Witters E Van Dongen W Slegers H Newton RP Van Onckelen H Esmans EL Stainless Steel Electrospray Probe A Dead End for Phosphorylated Organic Compounds J Chromatogr A 2006 1104(1-2) 209–221
19. Walter TH Alden BA Blaze M Boissel C DeLano M Field J Lawrence N Osterman D Patel A Characterization of New MS-Compatible Mixed-Mode Reversed-Phase Anion-Exchange HPLC columns J Chromatogr A 2020 Submitted for publication
20. Chen S Zhang J Liao D Qian MG A Novel Dynamic Flush Method to Reduce Column-Related Carryover J Chromatogr Sci 2014 52(8) 950–953
21. Welch CJ Gong X Schafer W Pratt EC Brkovic T Pirzada Z Cuff JF Kosjek B MISER Chromatography Multiple Injections in A Single Experimental Run The Chromatogram is the Graph Tetrahedron Asymmetry 2010 21(13-14) 1674–1681