Analysis of siRNA Drugs at Denaturing UPLC Conditions Using MaxPeak Premier Column Technology

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, zejména siRNA, představují rychle se rozvíjející třídu léčiv s potenciálem cílené modulace genové exprese. Pro jejich vývoj a kontrolu kvality je nezbytná robustní kvantitativní a separační analýza, která dokáže spolehlivě rozlišit komplementární vlákna vzniklá denaturací duplexu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ověřit schopnost kolony ACQUITY Premier Peptide BEH C18 (300 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm) vybavené MaxPeak HPS technologií pro denaturační IP-RP UPLC analýzu siRNA léčivého kandidáta. Studie srovnala nové hybridní povrchové řešení s konvenčními nerezovými kolónami se zaměřením na přesnost kvantifikace, linearitu, opakovatelnost a stabilitu signálu.

Použitá metodika a instrumentace

Ion-pair reverzní fázová UPLC při zvýšené teplotě (75 °C) umožnila kompletní denaturaci siRNA duplexu na jednotlivá vlákna. Metodika zahrnovala:

• Mobilní fáze A: 5 mM TEA/60 mM HFIP ve vodě
• Mobilní fáze B: 70/30 (% v/v) metanol/acetonitril
• Gradientní eluce s kombinovanými fázemi C a D pro optimalizaci retence
• Injekční objem 3 µL, detekce UV při 260 nm (titanová kyveta 5 mm)

Instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System s QSM, CM-A, APH, FTN SM a PDA detektorem
• Empower 3.0 pro integraci a kvantifikaci dat
• Testované kolony: konvenční ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 (300 Å) versus ACQUITY Premier Peptide BEH C18 (300 Å) s MaxPeak HPS

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání prokázalo, že na konvenční nerezové kolóně probíhá značná nespecifická adsorpce oligonukleotidů na kovové povrchy, což vyžaduje opakované kondicionování až k dosažení stabilní recovery. První injekce vykazovaly až o 20 % nižší signál než pozdější.
Naopak ACQUITY Premier kolona odstraňuje potřebu složitého kondicionování díky hybrid-silicovému povrchu. Recovery byla stabilní napříč čtyřmi po sobě jdoucími injekcemi s RSD < 2 % pro koncentraci 100 % a < 15 % pro detekční limit (0,2 %). Lineární kalibrace v rozsahu 0,2–200 % pro dvojici siRNA molekul vykázala korelační koeficient 0,9995. Konvenční kolona nedokázala spolehlivě kvantifikovat nejnižší koncentrace (0,2 a 1 %), signál se blížil nule.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění nežádoucí adsorpce siRNA na kovových částech chromatografické cesty
• Zrychlení nasazení metody bez dlouhého kondicionování kolony
• Výrazné zlepšení opakovatelnosti a přesnosti kvantifikace
• Vhodné pro rutinní QC analýzu siRNA ve farmaceutickém výzkumu a výrobě

Budoucí trendy a možnosti využití

Se stoupajícím počtem klinických studií oligonukleotidů poroste poptávka po vysoce výkonných, kovům odolných kolónách. Hybridní povrchy MaxPeak HPS lze očekávat také v LC-MS aplikacích, pro analýzu dalších kyselých biomolekul a v automatizovaných robustních pracovních postupech podle GMP standardů.

Závěr

ACQUITY Premier Peptide BEH C18 kolona s MaxPeak HPS technologií poskytuje spolehlivou denaturační UPLC analýzu siRNA léčiv bez potřeby dlouhodobého kondicionování. Metoda splňuje požadavky na recovery, opakovatelnost i linearitu a výrazně zvyšuje důvěryhodnost kvantitativních výsledků.

Reference

• Lundin KE, Gissberg O, Smith CIE. Oligonucleotide Therapies: The Past and Present. Hum Gene Ther. 2015;26:475–485. doi:10.1089/hum.2015.070
• Khvorova A, Watts JK. The Chemical Evolution of Oligonucleotide Therapies in Clinical Utility. Nat Biotechnol. 2017;35:238–248
• DeLano M et al. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal Chem. 2021;93:5773–5781. doi:10.1021/acs.analchem.0c05203
• Gilar M, DeLano M, Gritti F. Mitigation of analyte loss on metal surfaces in liquid chromatography. J Chromatogr A. 2021;1650:462247
• Tuytten R et al. Stainless-steel Electrospray Probe: A Dead End for Phosphorylated Organic Compounds. J Chromatogr A. 2006;1104:209–221
• Lauber MA et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper. 2021;720006930EN
• Walter TH et al. Faster Time to Results for Ultra-Performance Liquid Chromatographic Separations of Metal-Sensitive Analytes. Chromatography Today. 2021;Feb/Mar:40–44
• Yogendrarajah P et al. Analysis of siRNA Duplexes at Non-denaturing UPLC Conditions Using MaxPeak Premier Column Technology. Waters Application Note. 2021;720007361EN