Reproducible Hydrophilic Interaction Chromatography for Denaturing and Non- Denaturing Analyses of Oligonucleotides Using GTxResolve Premier BEH Amide Columns

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů je klíčová pro vývoj moderních léčiv založených na nukleových kyselinách. Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) nabízí efektivní rozlišení vysoce polárních oligonukleotidů bez použití iontově párujících činidel, která mohou negativně ovlivnit výkon chromatografických a hmotnostně spektrometrických systémů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na demonstraci reprodukovatelné HILIC separace oligonukleotidů o velikosti až 100 nukleotidů pomocí GTxResolve Premier BEH Amide 300 Å, 1,7 µm kolon. Dále byly testovány podmínky jak nondenaturing, tak denaturing analýzy siRNA pro impurity profiling a charakterizaci jednouvláknových komponent.

Použitá metodika a instrumentace

Výzkum využil následující instrumentaci a podmínky:

• Kolona: GTxResolve Premier BEH Amide 300 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm
• Mobilní fáze A (ssDNA): 50 mM acetát amonný, 10 % acetonitril, 10 % methanol
• Mobilní fáze B (ssDNA): 50 mM acetát amonný, 70 % acetonitril, 10 % methanol
• Mobilní fáze A (siRNA): 50 mM acetát amonný, 75 % voda, 25 % acetonitril
• Mobilní fáze B (siRNA): 50 mM acetát amonný, 75 % acetonitril, 25 % voda
• LC systém: ACQUITY Premier System (BSM, FTN-SM, UPLC pumpa s aktivním předehřívačem)
• Detektor: UV/PDA (500 nL flow cell), λ=260 nm
• Průtok: 0,4 mL/min (ssDNA), 0,3 mL/min (siRNA)
• Teplota kolony: 40 °C (ssDNA), 25 °C (siRNA nondenaturing), 60 °C (siRNA denaturing)
• Injekce: 1 µL vzorku

Hlavní výsledky a diskuse

GTxResolve Premier BEH Amide kolony prokázaly vynikající rozlišení oligonukleotidů od 20 do 100 merů s minimálním šumem a vynikající symetrií píků. Široké póry 300 Å a povrchy MaxPeak HPS výrazně omezily nespecifickou adsorpci a zaručily okamžitou použitelnost bez pasivace. Mezi jednotlivými šaržemi byla potvrzena vynikající reprodukovatelnost retenčních časů. Zvýšení teploty kolony umožnilo přechod do denaturing režimu a separaci siRNA duplexů na jednotlivé jednouvláknové komponenty.

Přínosy a praktické využití metody

HILIC na BEH Amide kolonách nabízí:

• Eliminaci iontově párujících činidel
• Vysokou reprodukovatelnost a robustnost separací vhodnou pro QA/QC v regulovaných prostředích
• Možnost analýzy kratších i delších oligonukleotidů jedním postupem
• Flexibilitu při přechodu mezi nondenaturing a denaturing podmínkami pro impurity profiling siRNA

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření HILIC aplikací na jiné biopolymery a komplexní biomolekuly, včetně rozvoje fází s vyšší pH a teplotní stabilitou. Kombinace s hmotnostní spektrometrií a automatizované QC platformy může dále zvýšit produktivitu a přesnost analýz.

Závěr

GTxResolve Premier BEH Amide 300 Å, 1,7 µm kolony poskytují vysoce reprodukovatelné a robustní HILIC separace oligonukleotidů až do 100 merů. Díky minimální adsorpci a možnosti jednoduše měnit režim analýzy jsou ideální volbou pro vývoj, DMPK studií a QC procesy u terapeutických nukleotidů.

Reference

1. Lardeux H. et al. Trends in Analytical Chemistry, 176 (2024):117758
2. Lardeux H. et al. Analytical Chemistry 96 (2024):9994
3. Goyon A. et al. Journal of Chromatography A, 1708 (2023):464327
4. Wei B. et al. Journal of Chromatography A, 1710 (2023):464414
5. Gilar M. et al. Journal of Chromatography A, 1712 (2023):464475
6. Hao Z. et al. Journal of Separation Science, 31 (2008):1449