Complete de novo sequencing of a human immunoglobulin G using multiple enzyme digests and LC-ESI-QTOF-MS/MS analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu bioterapeutik v diagnostice i terapii. Pro jejich vývoj a srovnávací studia biosimilars je nezbytné znát přesnou aminokyselinovou sekvenci celého IgG. V případech, kdy není dostupné cDNA nebo došlo ke ztrátě hybridomové buněčné linie, přijdou ke slovu analytické techniky de novo sekvenování na úrovni proteinu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat kompletní de novo určení sekvence lidské monoklonální IgG1 (AF165) bez předchozích znalostí genu. Výzkum kombinoval několik proteolytických štěpení, vysoce rozlišenou LC-ESI-QTOF-MS/MS analýzu a bioinformatické sestavení sekvence v softwaru PEAKS AB 2.0. Klíčovým ukazatelem úspěchu bylo dosažení 100% pokrytí obou lehkého i těžkého řetězce včetně CDR oblastí.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: 30 µg rekombinantní lidské IgG1

• Štěpení: Trypsin, chymotrypsin, elastáza, pepsin, AspN/LysC, GluC/LysC
• Příprava vzorků: oddeglykozylace PNGase F, denaturace a redukce DTT, alkylace IAA
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity UHPLC; kolona Waters ACQUITY UPLC Peptide CSH C18 (150×2,1 mm, 1,7 µm)
• Eluce: gradient 2–40 % acetonitrilu v 72 min při 40 °C, 200 µL/min
• Hmotnostní spektrometrie: Bruker impact II QTOF s ESI, režim AutoMS/MS top 20, rozsah m/z 150–2200
• Bioinformatika: PEAKS AB 2.0 s tolerancí 10 ppm (MS) a 0,05 Da (MS/MS), modifikace carbamidomethylace, oxidace, deamidace, pyro-Glu

Hlavní výsledky a diskuse

Kombinací šesti enzymatických štěpení bylo získáno dostatečné překrývání peptidů pro sestavení obou řetězců se 100% pokrytím. Software PEAKS AB automaticky generoval De Bruijnův graf, sestavil sekvenci a odlišil isobarické zbytky Leu/Ile na základě homologie a výskytu v PSM. Sekvence CDR regionů byla určena s vysokou důvěrou a potvrzena závěrečnou manuální kontrolou spekter. Celkový workflow od přípravy vzorku po finální editaci zabral 7–8 dní.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost spolehlivého de novo sekvenování monoklonálních protilátek bez genetických informací
• Rychlý a rutinně aplikovatelný protokol v rámci 4–8 dnů
• Automatizace většiny kroků s minimální manuální editací
• Vysoká přesnost určení CDR oblastí a posttranslačních modifikací (pyro-Gln)

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení kapacity a přesnosti de novo sekvenování díky vyššímu rozlišení hmotnostních analyzátorů a pokročilejším algoritmům strojového učení. Integrace top-down metod a pohyb k multi-omics přístupu může zvýšit robustnost identifikace proteoform. V biotechnologii i farmaceutickém průmyslu se de novo workflow stane standardní součástí validace nových protilátek a kontroly kvality biosimilars.

Závěr

Popsaný přístup umožnil plné de novo určení sekvence lidské monoklonální IgG1 s 100% přesností, včetně všech CDR a N-terminální modifikace. Kombinace vícenásobných enzymatických štěpení, vysokorozlišovací LC-ESI-QTOF-MS/MS a specializovaného softwaru PEAKS AB představuje efektivní a prakticky využitelnou metodiku pro rutinní sekvenování protilátek.

Reference

• Bandeira N, et al. Automated de novo protein sequencing of monoclonal antibodies. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1336–8.
• Tran NH, et al. Complete De Novo Assembly of Monoclonal Antibody Sequences. Sci Rep. 2016;6:31730.