Extensive LC-Top-Down MS Sequence Confirmation of the NISTmAb Reference Material 8671

Význam tématu

Charakterizace terapeutických monoklonálních protilátek vyžaduje detailní ověření primární sekvence, lokalizaci posttranslačních modifikací a potvrzení disulfidických můstků. Moderní top-down přístupy využívající LC-MALDI-TOF/TOF s in‐source decay (ISD) nabízejí rychlou a spolehlivou validaci velkých proteinových fragmentů s vysokou sekvenační přesností.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a aplikovat workflow pro rozsáhlé sekvenční potvrzení NISTmAb referenčního materiálu 8671. Autoři kombinovali enzymatickou štěpnou reakci IdeS, střední redukci a LC‐MALDI-TOF/MS top-down analýzu k identifikaci N‐ i C‐terminálních modifikací a k ověření podjednotek Fd, Fc/2 a lehkého řetězce (LC).

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla NISTmAb IdeS štěpena a redukována v 6 M guanidiniovém chloridu a DTT. Frakce proteinových podjednotek separované na nanoElute s kolonou FortisBio C4 byly zachytávány spotOn fraction collectorem s inertním plynem (N₂) pro potlačení oxidace. Vzorky byly automaticky nanášeny na MTP AnchorChip 384 s matricí sDHB. Analýza probíhala na rapifleX MALDI-TOF/TOF v reflektorovém módu s ISD. Řídicí software: Hystar 5.0 se spotOn plug-inem a BioPharma Compass 3.0.

Hlavní výsledky a diskuse

LC-MALDI separace dosáhla jasného rozlišení frakcí:

• Fc/2 při retenčním čase 31,5 min
• LC při 33,5 min
• Fd při 35,5 min

Top-down ISD analýza poskytla:

• Lehký řetězec (LC): sekvenační pokrytí 73,2 %, validační pokrytí (SVP) 85,4 %, plné potvrzení CDR oblastí.
• Fragment Fd: pokrytí 61 %, SVP 72 %, detekce N‐terminální pyro‐glutaminace.
• Fragment Fc/2: potvrzení C‐terminálního odštěpení lysinu, dominantní glyková forma G1F (SVP ~75 %), lokalizace glykoformy u N61.

Inertní plynová ochrana významně snížila oxidativní artefakty, což vedlo k vyšší datové kvalitě.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený LC-MALDI-TDS workflow umožňuje rychlou a spolehlivou validaci primární struktury velkých antikorových fragmentů (až 70–90 aminokyselin) včetně modifikací a CDR regionů. Metoda je plně automatizovaná a vhodná pro rutinní QA/QC v biopharmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření automatizace, integrace de novo sekvenování neznámých proteinů a aplikace na široké spektrum bioléčiv. Využití metody v proteomických studiích slibuje rychlou a precizní analýzu komplexních molekul.

Závěr

Prezentovaný přístup kombinuje výhody LC‐MALDI a top-down ISD pro detailní potvrzení sekvence mAb subjednotek s vysokou přesností. Automatizace přípravy vzorků a robustnost dat podporují jeho využití v biopharmaceutickém výzkumu a kontrole kvality.

Reference

1. Resemann A. et al., Full validation of therapeutic antibody sequences by middle-up mass measurements and middle-down protein sequencing. MAbs 8(2):318–330, 2016.
2. Consortium for Top-Down Proteomics, Monoclonal Antibody Project (preprint).
3. Resemann A. et al., Top-down de novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by MALDI-TOF/TOF. Anal Chem 82(8):3283–3292, 2010.