Is 2D HPLC the Answer for You

Význam tématu

2D-LC nabízí zvýšenou selektivitu a kapacitu separace pro komplexní vzorky, kde jednorozměrné metody selhávají. Umožňuje detailní rozlišení stopových látek, identifikaci nečistot a čištění vzorků bez nutnosti vícestupňové přípravy.

Cíle a přehled článku

• Popis principu 2D-LC a motivace pro jeho použití: zvýšení kapacity, ortogonální separace, potvrzení čistoty hlavních špiček.
• Představení srdcových řezů (heart-cutting) a komplexního režimu (comprehensive) 2D-LC.
• Ukázky aplikací na taxany, pivní vzorky, proteinové biopreparáty, oligonukleotidy a další.

Použitá metodika

• Heart-cutting 2D-LC: výběr jedné či více frakcí z první dimenze pro druhou dimenzi.
• Komplexní 2D-LC: kontinuální přenos celého eluátu první dimenze do druhé s velmi rychlými gradienty.
• HiRes 2D-LC: vícenásobné řezy jedné chromatografické špičky pro přesnou kvantifikaci souvisejících látek.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC System s 2D-LC ventilem; OpenLab ChemStation s 2D-LC add-on, LC Image software.
• Kapalinové pumpy 1260/1290 Infinity Binary Pump; autosampler 1260 Infinity nebo 1290 Infinity; detektor DAD G4212A; QTOF.
• Chromatografické kolony: ZORBAX RRHD (C18, HILIC), AdvanceBio (C4, Oligonucleotide, AAA), Poroshell SB, PLRP-S, Bio MAb, Bio WCX, Bio SEC, chirální kolony (Chiral-V, T, CD, CF).

Hlavní výsledky a diskuse

• Taxany: kompletní separace hlavních špiček včetně paclitaxelu z extraktu yewu díky optimalizovaným gradientům.
• Pivo: kombinace SEC, IEX a RP v 1D s RP v 2D zlepšila rozlišení mnoha složek komerčních japonských vzorků.
• Peptidové mapování trastuzumabu (HILICxRP) odhalilo oxidované formy s vysokou ortogonalitou.
• Oligonukleotidy: online desalinace následovaná IP-RP zajistila efektivní separaci v přítomnosti vysokého soli bez offline přípravy.
• Rituximab: MHC 2D-LC umožnil odsolení po WCX a následnou analýzu glykoforem s QTOF identifikací variant.
• Green tea: HiRes 2D-LC přesně kvantifikovala kofein a epigalokatechin galát v extraktu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší kapacita separace a detekce skrytých špiček v komplexních matricích.
• Zkrácení celkového času analýzy optimalizací gradientů v druhé dimenzi.
• Automatizace workflow s online odsolováním, srdcovými řezy a přímým přenosem frakcí.
• Flexibilita kombinace režimů a kolonek pro farmaceutický, biotechnologický i potravinářský průmysl.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj vysokorozlišených 2D-LC postupů pro analýzu biopolymerů (proteiny, oligonukleotidy).
• Propojení s online MS pro multidimenzionální detekci a kvantifikaci v reálném čase.
• Vylepšené softwarové nástroje pro analýzu a vizualizaci 2D chromatogramů.
• Miniaturizace a akcelerace metod pro vysokopropustné screeningové studie.

Závěr

2D-LC výrazně rozšiřuje možnosti kapalinové chromatografie tím, že kombinuje různé separační principy do jednoho protokolu. Díky široké instrumentální podpoře a flexibilitě metod lze efektivně řešit různé analytické úlohy, od identifikace nečistot až po charakterizaci biotechnologických produktů. Další inovace v instrumentaci a softwaru budou pokračovat v zvyšování výkonu a dostupnosti 2D-LC metod pro rutinní i výzkumné aplikace.

Reference

• D. Li, O. J. Schmitz. Use of Shift Gradient in the Second Dimension to Improve the Separation Space in Comprehensive Two-dimensional Liquid Chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6511-6517 (2013).