Agilent AdvanceBio Desalting-RP Cartridges for Online Desalting in 2D‑LC/MS mAb Analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčovými bioterapeutiky s vysokou molekulární komplexitou, podléhají posttranslačním modifikacím, agregaci a degradaci. Pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti je nezbytné detailní analytické charakterizování jednotlivých variant. Kombinace dvoudimenzionální kapalinové chromatografie (2D-LC) s hmotnostní spektrometrií (MS) umožňuje separaci i strukturní analýzu těchto variant. Nicméně přítomnost nevolatilních solí z prvního rozměru brání citlivé MS detekci, a proto je efektivní online desalting zásadní pro dosažení kvalitních dat.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na implementaci Agilent AdvanceBio Desalting-RP cartridge jako druhého rozměru pro online desalting frakcí z první chromatografické separace. V prvním rozměru byly využity iontově výměnné (IEX) a afinitní (Protein A) kolony pro analýzu nábojových variant a zachycení mAb. Následný krok zahrnoval online desalting frakcí před vstupem do Q-TOF MS. Výsledky byly hodnoceny na příkladech inovátorských i biosimilárních mAb.

Použitá metodika

• První dimenze: IEX separace pomocí Bio MAb PEEK kolony (WCX) nebo afinitní Protein A monolitická kolona.
• Desalting: Agilent AdvanceBio Desalting-RP cartridge se 1000 Å pórovitostí.
• Přenos: víceřezové heart-cutting s časovými segmenty odpovídajícími retencím v 1. dimenzi.
• Chromatografické podmínky: gradienty solí pro IEX, rychlý organický gradient (0,1 % FA/ACN) pro RP desalting.
• MS detekce: Q-TOF s teplotou plynu 350 °C, nebulizérem 35 psi a fragmentorem 200 V.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity 2D-LC: kvaternární pumpa, binární pumpa, autosampler s termostatem, termostatované kolony, ventily a heart-cutting moduly.
• Agilent AdvanceBio Desalting-RP cartridge (2,1 × 12,5 mm, 10 µm, 1000 Å).
• Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS s Agilent OpenLAB CDS a MassHunter softwarem.

Hlavní výsledky a diskuse

• IEX → Desalting-RP: Inovátor i biosimilární mAb prokázaly separaci hlavního vrcholu a bazických či kyselých variant. Dekonvolucí MS dat byly identifikovány C-terminální lyzinové truncace (rozdíl 128 Da).
• Afinitní zachycení → Desalting-RP: Protein A zachytil hlavní frakce mAb, které po online desaltingu vykázaly čisté hmotnostní spektrum s jednotlivými glykoformami (G0F, G1F, G2F).
• Desalting-RP cartridge účinně odstraňují nevolatilní soli, což vede ke kvalitnímu spektru bez nutnosti offline úprav.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby analýzy díky eliminaci offline desaltingu.
• Zvýšení reprodukovatelnosti a robustnosti v QC a výzkumných laboratořích.
• Možnost detailní charakterizace nábojových variant a glykoform v jediné 2D-LC/MS sekvenci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s vysoce výkonnými hmotnostními detektory pro ještě vyšší rozlišení.
• Rozšíření na analýzu konjugovaných protilátek (ADC) a komplexních biokonjugátů.
• Automatizované workflow v kombinaci s umělou inteligencí pro rychlejší zpracování dat.

Závěr

Online desalinace pomocí Agilent AdvanceBio Desalting-RP cartridge v 2D-LC/MS workflow pro mAb poskytuje rychlý, efektivní a spolehlivý přístup k charakterizaci nábojových variant a glykoform. Metoda zvyšuje kvalitu MS dat a optimalizuje laboratorní kapacitu.

Reference

1. Buckenmaier S. Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution for Multiple Heart-Cutting, Agilent Technologies Application Note, 5991-5615EN, 2015.
2. Krieger S. Application of Multiple Heart-Cutting 2D-LC in Method Development for Impurity Analysis – The Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution, Agilent Technologies Application Note, 5991-5643EN, 2015.
3. Sandra K.; Vanhoenacker G.; Vandenheede I.; Steenbeke M.; Joseph M.; Sandra P. Multiple heart-cutting and comprehensive two-dimensional liquid chromatography hyphenated to mass spectrometry for the characterization of the antibody-drug conjugate ado-trastuzumab emtansine. Journal of Chromatography B, 2016. DOI:10.1016/j.jchromb.2016.04.040.