2D-LC as an Automated Desalting Tool for MSD Analysis Direct Mass Selective Detection of a Pharmaceutical Peptide from an MS-Incompatible USP Method

Význam tématu

V oblasti farmaceutického výzkumu hrají peptidy a proteiny klíčovou roli při vývoji léčiv. Jejich složitá struktura a citlivost na degradaci vyžadují přesné oddělení a identifikaci nežádoucích produktů. Těžko rozpustné nebo nevolatilní pufry běžně používané v HPLC metodách zkříženě komplikují přímou detekci hmotnostní spektrometrií (MS). Online metoda dvoudimenzionální kapalinové chromatografie (2D-LC) s automatickým odsolováním představuje praktický postup pro bezprostřední analýzu biologických makromolekul bez offline zásahů.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované aplikace je demonstrovat využití vícenásobného odebírání srdcovek (MHC) ve 2D-LC jako automatického odsolovacího kroku pro přímé spojení USP 39 metody na kvantifikaci glukagonu se selektivní hmotnostní detekcí (MSD). První dimenze podle USP 39 využívá MS nekompatibilní fosfátový pufr, ve druhé dimenzi pak dojde k online odsolení a následné analýze pomocí jednoskupinového hmotového spektrometru.

Použitá metodika

1. První dimenze (1D):

• Kolona: C18 ZORBAX Eclipse Plus (3,0 × 150 mm; 3,5 µm)
• Mobilní fáze: A – 16,3 g KH2PO4 v 800 mL vody (pH 2,7) a 200 mL acetonitrilu; B – voda/acetonitril 60/40
• Gradient: izokratická fáze 33,8 % B (0–30 min), následně až 88 % B (34–35 min) a návrat na výchozí podmínky
• Detekce: UV při 214 nm

2. Druhá dimenze (2D) – odsolení a MSD:

• Kolona: AdvanceBio Desalting-RP (2,1 × 12,5 mm)
• Mobilní fáze: voda/0,1 % kyselina mravenčí (A) a acetonitril/0,1 % kyselina mravenčí (B)
• Gradient: izokraticky 5 % B po 1 min, rychlý nárůst na 80 % B do 1,5 min
• Mód: vícenásobné srdcovkové odebírání (časově i na základě prahu signálu)
• MSD: Agilent 6150 Single Quad, ESI pozitivní ionizace, m/z 600–1350, fragmentor 100 V

Použitá instrumentace

Agilent InfinityLab 2D-LC Solution (pumpy 1290 Infinity II, chladicí multisampler, termostat, ventilové pohony) včetně 2D-LC softwaru A.01.04
Hmotový detektor: Agilent 6150 Single Quadrupole LC/MS s ESI zdrojem Jet Stream
Kolony: ZORBAX Eclipse Plus C18; AdvanceBio Desalting-RP
Reagencie: LC-grade acetonitril, ultrapure voda, KH2PO4, kyselina mravenčí, glukagon (syntetický), kyseliny HCl a fosforečná

Hlavní výsledky a diskuse

1D část splnila požadavky USP 39: RSD retenční doby glukagonu < 0,3 %, RSD plochy < 0,2 %, faktor špičkování 1,3 a rozlišení vůči prvním deamidovaným tvarům > 2,3. 2D-LC efektivně odstranila soli z pufrové fáze, což potvrdila absence aduktů v TDIC a EIC chromatogramech. Glukagon byl detekován ve formě [M+5H]5+, [M+4H]4+ a [M+3H]3+. Deamidované deriváty vykazovaly jednotkový přírůstek hmotnosti, potvrzující nástup deamidace asparaginu/glutaminu. Časově i signálem řízené odebírání umožnilo získat hmotové spektrum pro všechny čtyři deamidované formy.

Přínosy a praktické využití metody

• Online přímé spojení MS nekompatibilní USP metody s hmotnostní detekcí bez offline zlomů
• Automatické odsolení eliminuje potřebu manuálního zásahu i sušení vzorku
• Rychlá a reprodukovatelná analýza peptidů v rutinním QA/QC i vývojových laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Dvourozměrné chromatografické postupy s automatickým odsolením lze rozšířit pro pokročilé fragmentační a vysokorozlišovací MS detektory. Potenciál spočívá v hlubší charakterizaci posttranslačních modifikací, screeningových metodách pro biologika a integraci do plně automatizovaných výrobních kontrol.

Závěr

MHC 2D-LC s Agilent InfinityLab a AdvanceBio Desalting-RP kartridžemi dokáže zabezpečit online odsolení a přímou MSD analýzu peptidu glukagonu z MS-nekompatibilního pufru dle USP 39. Metoda splnila systémové požadavky, poskytuje vysokou citlivost a může být adaptována pro další biomolekulární aplikace.

Reference

1. Luo H. et al. On-line desalting tool allowing peptide identification directly from MS-unfriendly HPLC methods. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 137, 139–145.
2. Petersson P., Haselmann K., Buckenmaier S. Multiple heart-cutting 2D-LC–MS: real-time impurity profiling of biopharmaceuticals. J. Chromatogr. A 2016, 1468, 95–101.
3. Suresh Babu C. V., Ravindra G. Agilent AdvanceBio Desalting-RP Cartridges for Online Desalting in 2D-LC/MS mAb Analysis. Agilent Appl. Note 2016, 5991-7066EN.
4. Joshi A. B., Rus E., Kirsch L. E. Degradation pathways of glucagon in acidic solutions. Int. J. Pharm. 2000, 203, 115–125.
5. United States Pharmacopeia USP 39. Official Monograph Glucagon. 2016.