Agilent AdvanceBio SEC 2.7 μm Columns - User guide

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) patří mezi klíčové analytické metody pro separaci a charakterizaci biomolekul, jako jsou proteiny, protilátky a peptidy. Díky šetrné separaci na základě velikosti molekuly umožňuje SEC monitorovat agregaci, fragmentaci a čistotu biologických vzorků, což je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality biologických léčiv.

Cíle a přehled článku

Článek popisuje doporučené pracovních podmínky a údržbu Agilent AdvanceBio SEC 2,7 µm sloupců pro analýzu biomolekul. Cílem je zajistit optimální separaci, dlouhou životnost sloupce a konzistentní chromatografické výsledky v rutinní laboratoři i v SEC-MS aplikacích.

Použitá metodika a instrumentace

• Mobilní fáze: 150 mM fosfátový pufr pH 7,0 (doporučeně), alternativní pufry s vysokou či nízkou koncentrací soli.
• Průtok: 0,1–2,0 mL/min pro 7,8 mm ID, 0,1–0,7 mL/min pro 4,6 mm ID, pro dvě sloupce v sérii snížit průtok.
• Teplota: doporučená 20–30 °C, maximálně 80 °C.
• Objem injekce: 5–10 µL (max. 1 % objemu sloupce).
• Detekce: UV/DAD při 220 nm, LS detektor kompatibilní.
• Regulace tlaku: pracovní tlak < 200 bar, max. 400 bar.

Použitá instrumentace

• Sloupcové systémy Agilent AdvanceBio SEC 300 Å a 130 Å, 2,7 µm, různé rozměry (7,8×300, 4,6×300 mm apod.).
• InfinityLab Quick Connect fitinky (stainless steel i bio-inertní).
• Agilent SEC standardy: proteiny od 1 000 do 670 000 Da pro kontrolu výkonu.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie prokázala vysoké rozlišení separace monomeru IgG a jejích agregátů a degradačních produktů. Ukázalo se, že optimální volba pH a koncentrace pufru minimalizuje nespecifické interakce se stacionární fází. Čištění sloupců za použití iontově silných solí, organických rozpouštědel či kyselých přísad efektivně obnovuje výkon bez poškození sloupce. Udržení tlaku pod mezní hodnotou a pomalé zvyšování průtoku prodlužuje životnost kolony.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje:

• Rychlou a reprodukovatelnou analýzu čistoty a agregace proteinů.
• Širokou kompatibilitu s biopharma QA/QC postupy.
• Možnost přímého napojení na hmotnostní spektrometr pro detailní charakterizaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace sloupců a rozvoj monolitických a hybridních materiálů pro zvýšení účinnosti a snížení spotřeby vzorku. Významný potenciál má integrace SEC s pokročilou hmotnostní spektrometrií a online bioanalytickými detektory pro komplexní charakterizaci proteinových konjugátů a nanočástic.

Závěr

Agilent AdvanceBio SEC 2,7 µm sloupce představují robustní a univerzální nástroj pro chromatografickou separaci biomolekul. Jemně optimalizované pracovní podmínky a pravidelná údržba zajišťují vysokou reprodukovatelnost, dlouhou životnost a spolehlivé výsledky jak v rutinní analýze, tak ve výzkumných aplikacích.

Reference

• Agilent Technologies, Inc. AdvanceBio SEC User Guide, Part Number: 5971-6580, 2021.
• DE44371.3050462963. Agilent AdvanceBio SEC Columns for Biomolecule Analysis.