Aggregate and Fragment Analysis - Agilent BioHPLC Columns Application Compendium

Význam tématu

Analýza agregátů a fragmentů bílkovin je zásadní pro zajištění kvality bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek. Sekvenční a vysokoúčinná kapalinová chromatografie (SEC/UHPLC) umožňuje rozdělení monomerů od vyšších agregátů či nižších fragmentů, což je klíčové pro bezpečnost a účinnost léčivých bílkovin.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat vývoj a optimalizaci SEC metody pro charakterizaci standardu NISTmAb (RM 8671) pomocí kolon Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1,9 µm. Studie využívá Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC systém a Buffer Advisor software k rychlému testu různých mobilních fází (pH, koncentrace fosfátového pufru, přídavek NaCl).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívá v isokratické SEC separaci s UV detekcí při 280 nm. Hlavní parametry:

• Kolona: Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1,9 µm, 4,6 × 300 mm
• LC systém: Agilent 1260 Infinity II Bio-inert (bio-inert quaternary pump, multisampler, multicolumn thermostat, DAD detector)
• Software: Agilent OpenLab CDS 2.2, Buffer Advisor
• Mobilní fáze: vodný roztok fosfátu sodného (25–350 mM) a NaCl (0–250 mM), pH 6,6–7,4

Hlavní výsledky a diskuse

Testování bez NaCl ukázalo, že 150 mM fosfát při pH 7,4 poskytuje nejlepší tvar vrcholu (Asym 1,41) a rozlišení dimer/monomer (Rs 2,78). Zvýšení koncentrace pufru nad 200 mM zlepšilo tvar, ale mírně snížilo rozlišení. V přítomnosti 250 mM NaCl byla optimální kombinace 50 mM fosfátu a 250 mM NaCl při pH 6,8 (Asym 1,33, Rs 2,86) s odpovídající HMW% blízko referenční hodnoty ~3 %. Nižší koncentrace pufru (25 mM) vyžadovaly vyšší pH k dosažení přesného kvantifikování agregátů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a reprodukovatelná kvantifikace agregátů a fragmentů mAb
• Minimalizace sekundárních interakcí díky polymerovému povlaku kolon AdvanceBio
• Efektivní vývoj metod pro QC laboratoře a výzkum bioterapeutik

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace SEC s MALS a nativními SEC-MS pro přímou charakterizaci molekulové hmotnosti
• Další zkracování analýz pomocí menších částic a vyšších průtoků ve formátu UHPLC
• Automatická optimalizace metod s podporou umělé inteligence a pokročilého softwaru

Závěr

Studie potvrdila, že Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1,9 µm ve spojení s bio-inert LC systémem a Buffer Advisor softwarem umožňuje rychlou a spolehlivou optimalizaci SEC metod pro analýzu NISTmAb. Optimální mobilní fáze byla identifikována jako 50 mM fosfát sodný + 250 mM NaCl, pH 6,8.

Reference

• Schiel J. E. et al. The NISTmAb Reference Material 8671: value assignment, homogeneity, and stability. Anal. Bioanal. Chem. 410 (2018) 2127–2139.