Calibrating your Agilent AdvanceBio SEC Columns

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) ve vodném prostředí představuje klíčovou metodu pro charakterizaci velikosti biomolekul a polymerů. Umožňuje přímé měření agregace proteinů, distribuce molárních hmotností polysacharidů či syntetických polymerů a monitorování stability vzorků. Pravidelná kalibrace slouží k zajištění reprodukovatelnosti analýz, rychlé detekci odchylek v chování kolony a minimalizaci výpadků při provozu HPLC systému.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje postup kalibrace sloupců Agilent AdvanceBio SEC s různými pórovitostmi (130 Å a 300 Å) pomocí standardů pro proteiny, polysacharidy a PEG/PEO. Cílem je demonstrovat optimální volbu mobilní fáze, rozsah rozlišení a zdůraznit význam pravidelné kontroly kolony pro udržení kvality analýz.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z principu velikostní exkluze: větší molekuly neprostupují póry výplně a eluují dříve, menší difundují do pórů a eluují později. Klíčové kroky:

• Výběr vhodné mobilní fáze (např. 150 mM fosfátový pufr pH 7,0; PBS pH 7,4; 0,1 M fosfát + 0,1 M sulforečnan)
• Příprava a rozpuštění standardů ve stejném pufru, filtrace vzorku
• Průběh chromatografie při průtoku 1,0 mL/min
• Detekce: RI pro polysacharidy a PEG/PEO, UV 220 nm pro proteiny a peptidy

Použitá instrumentace

• Kolony Agilent AdvanceBio SEC 130 Å a 300 Å, 2,7 µm, 7,8×300 mm
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC systém
• UV detektor a refrakční indexový detektor

Hlavní výsledky a diskuse

Byly získány kalibrační křivky závislosti retenčního času na logaritmu molární hmotnosti pro různé typy standardů. Klíčové poznatky:

• Sloupce 130 Å nabízejí vyšší retenci malých molekul, 300 Å jsou vhodnější pro vyšší molární hmotnosti
• Polysacharidy a PEG/PEO vykazují ostré, úzké pásy; u malých oligomerů lze zlepšit rozlišení zapojením dvou kolon v sérii
• Mobilní fáze s vyšší iontovou silou potlačuje nežádoucí sekundární interakce u proteinů, což zvyšuje konzistenci retenčních časů a rozlišovací schopnost dimer/monomer

Přínosy a praktické využití metody

Pravidelná kalibrace zajišťuje přesné stanovení rozmezí pracovních molárních hmotností kolony a umožňuje monitorovat její výkonnost v čase. V biotechnologii se metoda využívá k hodnocení agregace terapeutických protilátek, v potravinářství a materiálových vědách k analýze distribuce velikosti polysacharidů a polymerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný vývoj zahrnuje:

• Nano- a mikro-SPE sloupce pro vysokorychlostní a ultra-mikroanalýzy
• Povrchové modifikace výplní minimalizující zbytkové interakce
• Kombinace SEC s hmotnostní spektrometrií pro přesnější charakterizaci komplexních směsí
• Automatizované on-line kalibrace a monitorování kondice sloupce

Závěr

Správná a pravidelná kalibrace Agilent AdvanceBio SEC sloupců s odpovídajícími standardy zvyšuje spolehlivost a přesnost velikostní exkluzní chromatografie. Díky tomu lze efektivně detekovat odchylky výkonu kolony, optimalizovat pracovní podmínky a zajistit bezproblémový provoz LC systému.

Reference

1. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10(4), 307–377.
2. Agilent Technologies: GPC/SEC standards: Product guide; 5990-7996EN.