Advances in Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Macromolecular Proteins

Význam tématu

Size-Exclusion Chromatography (SEC) je základní technika pro dělení makromolekulárních proteinů podle velikosti bez interakcí s fixační fází. Moderní sub-3 µm částice s větší pórovitostí (450 Å) v rámci UPLC (SE-UPLC) umožňují lepší rozlišení a rychlejší analýzu vysoce agregovaných proteinů a multimérů, což je klíčové v biotechnologickém výzkumu, vývoji biologických léčiv a kvalitativní kontrole.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo:

• Ověřit sloupcovou reprodukovatelnost a dlouhodobou stabilitu nové ACQUITY UPLC BEH450 SEC kolony (2,5 µm, 450 Å).
• Porovnat chromatografické vlastnosti sub-3 µm BEH450 s tradičními 8 µm HPLC částicemi.
• Ukázat komplementaritu BEH450 a BEH200 SEC sloupců při sériovém zapojení za účelem rozšíření rozsahu molekulových hmotností.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separace bylo použito Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System vybavené:

• ACQUITY UPLC BEH450 SEC kolony (450 Å, 2,5 µm; 4,6×150 mm a 4,6×300 mm).
• ACQUITY UPLC BEH200 SEC kolony (200 Å, 1,7 µm; 4,6×150 mm a 4,6×300 mm).
• ACQUITY UPLC TUV detektor (280/214 nm) a Wyatt miniDAWN TREOS MALLS detektor.
• Auto•Blend Plus pro přípravu 25 mM fosfátového pufru s 250 mM NaCl, pH 6,8.
• Software Waters Empower Pro a Waters UNIFI pro sběr a zpracování dat, Wyatt Astra pro MALLS analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Reprodukovatelnost a stabilita:

• Pěti kolony BEH450 (300 mm) z různých výrobních šarží vykázaly průměrnou odchylku retence 0,017 min.
• Stabilitu prokázalo >800 injekcí bez významného posunu retence thyroglobulinu a bez změny asymetrie špičky uracilu.

2. Porovnání částic 2,5 µm vs. 8 µm:

• Sub-3 µm BEH450 sloupec vyústil v ostřejší, vyšší citlivost a dvojnásobné rozlišení apoferritinu monomer/dimer (R=2,49 vs. 1,42).

3. Rozšíření rozsahu MW sériovým zapojením:

• BEH200 (200 Å) dává výborné rozlišení do ~150 kDa, BEH450 (450 Å) nad ~600 kDa.
• Při sériovém řazení BEH200+BEH450 se rozšiřuje pseudo-lineární rozsah kalibrace a rozlišují se jak nízkomolekulární, tak vysokomolekulární formy.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce reprodukovatelné a stabilní sloupce pro rutinní QC analýzy proteinů a agregátů.
• Zrychlené separace s lepším rozlišením díky sub-3 µm částicím.
• Možnost analýzy širokého rozsahu molekulových hmotností kombinací sloupců.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace částic a optimalizace pórovitosti pro rozšíření MW rozsahu nad 2 MDa.
• Integrace SE-UPLC s hmotnostní spektrometrií a MALLS pro komplexní charakterizaci multimérů.
• Automatizované workflow a online monitoring stability kolony pro vysokoprůchodové provozy.

Závěr

Nova ACQUITY UPLC BEH450 SEC kolona ve spojení s UPLC systémem poskytuje vysokou reprodukovatelnost, vynikající stabilitu a dvojnásobné rozlišení oproti tradičním HPLC částicím. Sériové zapojení s BEH200 SEC dále rozšiřuje analyzovatelný rozsah molekulových hmotností od nízkomolekulárních peptidů až po velké proteinové agregáty.

Reference

1. Porath J., Flodin P. Gel filtration: a method for desalting and group separation. Nature. 1959;183:1657–1659.
2. Fountain KJ., Hong P., Serpa S., Bouvier ESP., Morrison D. Analysis of Biomolecules by Size-Exclusion UltraPerformance Liquid Chromatography. Waters Application Note WA64226. 2010.
3. Hong P., Koza S., Fountain KJ. Advances in Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Small Proteins and Peptides. Waters Application Note 720004412en. 2012.
4. Hong P., Fountain KJ. Method Development for Size-Exclusion Chromatography of Monoclonal Antibodies and Higher Order Aggregates. Waters Application Note 720004076en. 2011.