A Novel HILIC Column for High Speed N-linked Glycan Analysis

Význam tématu

Analýza N-vázaných glykosidických vazeb na monoklonálních protilátkách je nezbytná pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a stabilního poločasu cirkulace terapeutických proteinů. Glykanové profily ovlivňují biologickou aktivitu a imunogenitu léčiv, proto je rychlá a spolehlivá chromatografická separace klíčová v biopharmaceutickém vývoji a kontrole kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo představit novou HILIC kolonu AdvanceBio Glycan Mapping (2,1 × 150 mm, 1,8 µm) pro vysokorychlostní i ultra vysoké rozlišení separace 2-AB značených N-vázaných glykánů z lidských IgG. Studie porovnává čas analýzy, rozlišení, šířku píků a kapacitu se stávajícími sloupci jiné značky a hodnotí chemickou stabilitu při dlouhodobém provozu.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnovalo enzymatické uvolnění glykánů z IgG, derivatizaci 2-aminobenzamidem a separaci HILIC metodou.

• Kolina: Agilent AdvanceBio Glycan Mapping, 2,1 × 150 mm, 1,8 µm
• Mobilní fáze A: 100 mM formiát amonný, pH 4,5; B: acetonitril
• Gradient pro rychlou analýzu: od 75 % B k 40 % B a zpět v časech do 13 minut
• Detekce: fluorescence (excitace 260 nm, emise 430 nm)
• Instrumentace: Agilent 1290 Infinity LC System s detektorem Agilent 1260 Infinity Fluorescence Detector

Hlavní výsledky a diskuse

Rychlá metoda (čas < 10 min) vs standardní separace:

• Průměrný retenční čas hlavních glykanů: 3,9 min
• Celkové rozlišení sousedních píků: RS 1,6–3,1
• Kapacita píků: 135 při 20 % B

Ultra vysoké rozlišení (čas ~12,7 min):

• RS 2,6–5,4, šířka píků 0,074 min, kapacita 221

Komparativní porovnání s jiným 2,1 × 150 mm HILIC sloupcem:

• 40% zkrácení doby analýzy při lepším rozlišení a užších píkech
• Ultra rychlý režim: 3,9 vs 4,3 min, RS zlepšeno o 50 % a kapacita +34 %

Stabilita:

• Konstantní retence a tvar píků po 5 000 injekcích při 60 °C

Přínosy a praktické využití metody

Nová HILIC kolona zkracuje analýzu oproti konkurenčním technologiím až o 40 %, přináší vyšší rozlišení a kapacitu píků, podporuje vysokopropustné rutinní měření glykanů v bioprodukci a kvalitativním a kvantitativním hodnocení protilátek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší implementace HILIC/LC–MS pro strukturuální charakterizaci glykanů, vývoj mikroproudových a nano-HILIC formátů pro vyšší citlivost, integrace automatizovaných přípravných platforem a využití strojového učení pro rychlou interpretaci glykanových profilů v personalizované medicíně.

Závěr

Agilent AdvanceBio Glycan Mapping kolona nabízí vyvážený poměr rychlosti, rozlišení a stability pro analýzu N-vázaných glykánů na IgG. Díky zkráceným časech a vyšší účinnosti separace přispívá k efektivnějšímu výzkumu i výrobě bioterapeutik.

Reference

1. Jefferis R. Biotechnol. Prog. 21, 11 (2005)
2. Arnold J. N. et al. Adv. Exp. Med. Biol. 564, 27 (2005)
3. Abès R., Teillaud J. L. Pharmaceut. 3, 146 (2010)
4. Ruhaak L. R. et al. Anal. Bioanal. Chem. 397, 3457 (2009)