Sensitive and Reproducible Glycan Analysis of Human Immunoglobulin G

Význam tématu

Glykanová analýza lidských imunoglobulinů G (IgG) je klíčová pro kontrolu kvality bioterapeutik i pro studium biomarkerů onemocnění. Správný vzorec glykosylace ovlivňuje stabilitu, účinnost a imunitní odpověď terapeutických protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

Tento Application Note popisuje citlivou a reprodukovatelnou analýzu N-vázaných glykanů z lidského IgG využitím systému Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC se sloupcem AdvanceBio 2.7 µm Glycan Mapping a fluorescenční detekcí. Stanovena byla přesnost retenčního času a plochy, linearita kalibrace, limity detekce a kvantifikace.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump (G5611A)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert High-Performance Autosampler (G5667A)
• Agilent 1290 Infinity Thermostat (G1330B)
• Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment (G1316C) s bio-inertními chladiči
• Agilent 1260 Infinity Fluorescence Detector (G1321B), FLD flow cell

Použitá metodika

Glykanové vzorky z lidského IgG byly derivatizovány 2-AB, separovány HILIC chromatografií na koloně AdvanceBio Glycan Mapping (2.1 × 150 mm, 2.7 µm) s mobilními fázemi acetonitril a 100 mM amonný formiát pH 4,5. Gradient běhu trval 51 minut, kolona byla temperována na 60 °C, FLD detekce při Ex. 260 nm/Em. 430 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Retenční časy glykanů vykázaly RSD < 0,27 % a plošné RSD < 3,5 % pro 15 hlavních forem. Linearita pro standardy M5, A2G2, A2G2S1, FA2G2S1, A2G2S2 v rozsahu 0,016–1 pmol vykázala koeficienty korelace > 0,999 (vyjma A2G2S1: 0,997). Limity detekce dosahovaly 9–12 fmol (S/N = 3) a limity kvantifikace 30–40 fmol (S/N = 10). Optimalizace Ex/Em vlnových délek významně zlepšila poměr signál/šum.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost pro sledování stopových glykanů
• Výborná reprodukovatelnost vhodná pro QA/QC procesy
• Rychlá analýza bioterapeutik i klinických vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace s hmotnostní spektrometrií pro přesnou identifikaci isobarických forem, automatizace přípravy glykanových vzorků, vývoj nových HILIC materiálů a pokročilý software pro pokročilou glykoanalýzu v klinickém i průmyslovém prostředí.

Závěr

Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC System ve spojení s AdvanceBio Glycan Mapping Column a fluorescenční detekcí poskytuje robustní, citlivou a velmi reprodukovatelnou metodu pro analýzu 2-AB derivatizovaných N-glykanů z lidského IgG, splňující požadavky moderního vývoje a kontroly kvality bioterapeutik.

Reference

• Jefferis R. Glycosylation of recombinant antibody therapeutics. Biotechnology Progress 2005, 21, 11–16.
• Omtvedt et al. Glycan Analysis of Monoclonal Antibodies Secreted in Deposition Disorders. Arthritis & Rheumatism 2006, 54(11), 3433–3440.
• Arnold et al. Human immunoglobulin glycosylation and the lectin pathway of complement activation. Adv Exp Med Biol 2005, 564, 27–43.
• Kanda et al. Comparison of biological activity among nonfucosylated therapeutic IgG1 antibodies. Glycobiology 2006, 17(1), 104–118.
• Chen & Flynn. Analysis of N-glycans from recombinant IgG by RP-HPLC/MS. Anal Biochem 2007, 370, 147–161.
• Huhn et al. IgG glycosylation analysis. Proteomics 2009, 9, 882–913.
• Fernandes D. Demonstrating comparability of antibody glycosylation. Eur Biopharm Rev 2005, Summer, 106–110.
• Melmer et al. HILIC analysis of fluorescence-labeled N-glycans. Anal Bioanal Chem 2010, 398, 905–914.
• Haxo et al. Integrated strategy for N-Glycan sample preparation. Prozyme Poster 2008.
• Domann et al. Separation-based glycoprofiling using fluorescent labels. Proteomics 2007, 1(2007), 70–76.
• Anumula KR. Advances in fluorescence derivatization for HPLC of glycoprotein carbohydrates. Anal Biochem 2006, 350, 1–23.
• Campbell et al. GlycoBase and autoGU: tools for HPLC-based glycan analysis. Bioinformatics 2008, 24(9), 1214–1216.