Fast and Efficient HILIC Methods for Improved Analysis of Complex Glycan Structures

Význam tématu

N-vázaná glykozylace představuje klíčovou post-translační modifikaci, která významně ovlivňuje bezpečnost, účinnost a farmakokinetiku terapeutických glykoproteinů.
Metody HILIC s fluorescenční detekcí a jejich kombinace s hmotnostní spektrometrií poskytují robustní nástroje pro detailní analýzu složité heterogenity glykanů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo optimalizovat rychlou a vysoce rozlišovací HILIC metodu založenou na sub-2 µm UHPLC sloupci s amido chemii pro profilování 2-AB značených N-glykanů z lidského IgG a kravského fetuinu.
Metodu jsme porovnali s komerčně dostupným sub-2 µm HILIC sloupcem za identických chromatografických podmínek.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrarychlou chromatografii jsme provedli na Agilent 1290 Infinity LC s 1260 Fluorescence detektorem.
HILIC kolona: AdvanceBio Glycan Mapping 2.1 × 150 mm, 1.8 µm amide.
Mobilní fáze: 100 mM formiát amonný (pH 4,5) / acetonitril (70:30) s gradientním rozvrhem.
Teplota kolony: 55 °C, teplota autosampleru: 10 °C.
Detekce FLD (Ex = 260 nm, Em = 430 nm).
Pro hmotnostní analýzu použit Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS (Dual JetStream zdroj, rozsah m/z 100–1 700).
Příprava vzorků zahrnovala denaturaci proteinu, enzymatické uvolnění glykanů, značení 2-AB a čištění na kazetách/plochách.

Hlavní výsledky a diskuse

• Separace 2-AB značeného dextranového žebříku (20 oligomerů) byla baseline vyloučena pod 15 minut.
• Ultravysoké rozlišení lidských IgG glykanů s časem analýzy pod 10 minut, což představuje 40 % zrychlení oproti jinému sub-2 µm HILIC sloupci.
• Hmotnostní spektra glykanů vykázala shodu teoretických a experimentálních hmotností do 6 ppm.
• Biantennární a triantennární struktury fetuin glykanů byly rozlišeny za méně než 12 minut.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení propustnosti laboratorních workflow pro kontrolu kvality glykozylace biologicky aktivních látek.
• Rychlá a přesná charakterizace heterogenity glykanů během vývoje, výroby a QA/QC procesů.
• Vhodné pro implementaci do rutiních analytických protokolů v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a integrace mikrofluidních systémů pro glykomiku.
• Propojení s MS/MS a vysokorychlostní hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturální analýzu.
• Automatizace workflow a využití strojového učení pro zrychlení a zlepšení interpretace dat.
• Rozšíření aplikací v oblasti glykomiky, biomarkerů a personalizované medicíny.

Závěr

Prokázali jsme, že HILIC metoda na sub-2 µm AdvanceBio Glycan Mapping sloupci dosahuje výjimečné rychlosti, rozlišení a reprodukovatelnosti při analýze N-glykanů. Metoda je ideální pro vysoko-propustné biocharakterizační laboratoře a rutinní QA/QC protokoly.

Reference

1. Martosella J., Potter O., Mancheno D., Liu J. Fast and Efficient HILIC Methods for Improved Analysis of Complex Glycan Structures. Agilent Technologies Application Note, 2017.
2. Posterová prezentace na 62nd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Baltimore, 15–19 June 2014.