Agilent Biocolumns - Glycan Analysis - Application Compendium

Význam tématu

Analýza N-olinovaných glykanů je klíčovou součástí charakterizace bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek (mAb), kde struktura a heterogenita glykanové části ovlivňují účinnost, stabilitu, farmakokinetiku a imunogenicitu léčiv. Regulátoři (FDA, EMA) považují glykování za kritický kvalitativní atribut, jehož sledování je nezbytné v průběhu vývoje, validace i sériové výroby biopoléčiv. Metody založené na štěpení glycanu, derivatizaci fluorogenními značkami a separaci pomocí HILIC kromě vysoké citlivosti nabízejí také možnost robustní kvantifikace a přesné identifikace glykoform.

Cíle a přehled studie / článku

Tento kompendium představuje souhrn profesionálních pracovních postupů, nástrojů a aplikací pro analýzu N-glykanů z glykoproteinů, včetně monoklonálních protilátek a modelových glykoproteinů (fetuin, ovalbumin). Popisuje manuální i plně automatizované workflow od enzymatického uvolnění N-glykanů (PNGase F) přes fluorogenní značení (2-AB, InstantPC) až po ultrarychlé HILIC metody a detekci pomocí fluorescenčního detektoru a LC/Q-TOF hmotnostního spektrometru. Cílem je zajistit vysoké rozlišení, citlivost, reprodukovatelnost a vysokou propustnost analytických sekvencí pro QA/QC i vývoj biosimilards.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow sestává z následujících kroků:

• Deglycosylace: PNGase F k uvolnění N-glykanů z proteinu.
• Labeling: Reduktivní aminační značení 2-aminobenzamidem (2-AB) nebo instantní glykozylaminové značení InstantPC pro zlepšení fluorescenční signálu a ionizace v MS.
• Čištění: HILIC díky amidosilika kolonám a SPE matricím k odstranění přebytečných reagen­sů.
• Separace: HILIC columna Agilent AdvanceBio Glycan Mapping (1,8 µm nebo 2,7 µm, 2,1×150 mm), gradient do 20–60 % vodného mobilního fáze ve 4–12 min.
• Detekce: Agilent 1260 Infinity II FLD (Ex=260–285 nm, Em=345–430 nm) a volitelně Agilent 6545XT/6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS.
• Automatizace: Agilent AssayMAP Bravo platforma se 96karetkami pro navazující moduly uvolnění, značení a SPE.

Hlavní výsledky a diskuse

• Vysoké rozlišení: Dvoukolonová konfigurace AdvanceBio (1,8 µm) umožnila separaci >20 struktur N-glykanů z mAb v <6 min, s plným baseline rozlišením i izomerů G1F(6)/G1F(3).
• Rychlost: Ve srovnání s konkurenční sub-2 µm stacionární fází ulkradění ~40 % času.
• Citlivost: InstantPC značky vs 2-AB projevily 2–3× vyšší MS signál a lepší fluorescenční odezvu.
• Reprodukovatelnost: Automatická příprava na AssayMAP Bravo (96 vzorků) dosáhla RSD <6 % pro area % i výšky vrcholu v mAb profilech.
• Kvantifikace: Vysoká korelace (R²>0,97) mezi FLD a MS relativní kvantifikací glykoform.
• Modelové proteiny: Fetuin a ovalbumin ukázaly oddělení >50 komplexních glykanových forem, což dokládá robustnost metody u různých vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Vývoj a komparabilita bioterapeutik: Monitorování glykanových profilů inovátorů a biosimilars.
• Kontrola kvality: Vysokopropustné skríningy procesních změn v kultivacích.
• Regulační podpora: Dokumentované, reprodukovatelné workflow vhodné pro validaci.
• Školitelnost: Uživatelsky přívětivé softwarové protokoly v Agilent VWorks/AssayMAP.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrovaná automatizace s vyšší hustotou vzorků (384 well) a miniaturizací kolonek.
• Vývoj nových fluorescenčních a MS značek pro detekci nižších abundancí glykanů.
• Pokročilá data mining nástroje, strojové učení pro předvídání glykostavu.
• Rozšíření metodiky na O-glykany, glykopeptidy, glykolipidové analýzy.
• Integrované glykoproteomické workflow s proteomikou, lipidomikou.

Závěr

Prezentované postupy a nástroje Agilent nabízejí komplexní a vysoce efektivní řešení pro vysoko-propustnou analýzu N-glykanů z bioterapeutik. Kombinace automatizované přípravy na platformě AssayMAP Bravo, modulárních kitů pro enzymatickou deglycosylaci a značení, vysoce účinné HILIC separace na AdvanceBio Glycan Mapping kolá­nách a citlivé FLD/MS detekce zajišťuje rychlou, reprodukovatelnou a validovatelnou glykantologii vhodnou pro vývoj i rutinní kontrolu kvality bioléčiv.

Reference

• Varki A. Sialic Acids in Human Health and Disease. Trends Mol Med. 2008;14(8):351–360.
• Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the PK/PD of mAbs and Fc-Fusion Proteins. J Pharm Sci. 2015;104(6):1866–1884.
• Anumula KR. Advances in fluorescence derivatization for LC Analysis of Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 2006;350:1–23.
• Fernandes D. Demonstrating comparability of antibody glycosylation during biomanufacturing. Euro Biopharm Rev. 2005;Summer:106–110.