Utilizing Enantiomeric Separations in Bioanalysis

Význam tématu

Enantiomerní separace mají klíčový význam v bioanalytice zejména pro odlišení farmakologicky aktivních forem látek.
Tradiční chirostacionární fáze na bázi celulózy či amylozy často vyžadují normální fázi, což komplikuje přímé napojení na LC-MS.
Makrocyklické glykosidické CSP (např. CHIROBIOTIC T) pracují v reverzní fázi a umožňují přímou analýzu biologických vzorků s vysokou selektivitou.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo:

• Otestovat řadu makrocyklických glykosidických CSP pro separaci enantiomerů vybraných β-blokátorů.
• Implementovat MS-kompatibilní mobilní fáze a zjednodušit přípravu vzorků.
• Porovnat klasickou precipitaci proteinů s hybridní SPE („HybridSPE-PPT“) pro eliminaci interferencí z plazmy potkana.

Použitá instrumentace

• HPLC systém: Agilent 1200RR s TOF detektorem 6210.
• Iontový zdroj: ESI+ pro režim reverzní fáze.
• Chromatografická kolona: CHIROBIOTIC T, 25 cm × 2,1 mm, 5 μm.
• Mobilní fáze: metanol a 15 mM dusičnan amonný (režim reverzní fáze).
• Průtok: 300 μL/min, teplota: 25 °C, objem injekce: 1 μL.
• Skenování hmotnostního spektra: 50–2000 m/z pro analyty, 450–850 m/z pro fosfolipidy.

Použitá metodika

1. Primární screening několika makrocyklických glykosidických CSP ukázal nejlepší univerzální výkon pro CHIROBIOTIC T.
2. Optimalizovaná mobilní fáze (metanol/15 mM NH4-formiát) umožnila přímou injekci zpracovaných plazmatických vzorků bez nutnosti odpařování a rekonstituce.
3. Příprava vzorků:

• Precipitace proteinů: 100 μL plazmy + 300 μL acetonitrilu s 1 % kyselinou mravenčí, odstředění, přímá analýza supernatantu.
• HybridSPE-PPT: 200 μL plazmy + 600 μL acetonitrilu s 1 % kys. mravenčí, odstředění, pasáž 400 μL supernatantu přes 96-well HybridSPE pod vakuem, přímá analýza filtrátu.

Hlavní výsledky a diskuse

• CHIROBIOTIC T selektivně rozlišil enantiomery osmi β-blokátorů (clenbuterol, metoprolol, sotalol, atenolol, alprenolol, pindolol, salbutamol atd.) s retenčními časy mezi 8,5–19,3 min.
• Extrahované iontové proudy (EIC) potvrdily vynikající separaci a citlivou detekci jednotlivých enantiomerů i při částečných koelucích.
• Metoprolol ukázal čistý chromatogram bez potlačení ionizace, což demonstruje kompatibilitu mobilní fáze s ESI+.
• HybridSPE-PPT výrazně snížila matriční interferenci fosfolipidů ve srovnání s klasickou precipitací, což vedlo k eliminaci ion-suppression efektu na časných analitech.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost přímé injekce zpracovaných plazmatických vzorků bez dodatečné úpravy.
• Zjednodušení workflow díky kompatibilitě CSP s reverzní fází a ESI+.
• Robustnost a opakovatelnost analýzy díky efektivnímu odstranění fosfolipidů pomocí HybridSPE.
• Vysoká selektivita pro enantiomery β-blokátorů relevantní pro klinické, PK a ADME/tox studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další třídy chirálních látek, včetně léčiv a metabolitů.
• Integrace s vysoce výkonnou hmotnostní spektrometrií pro multiplexní stanovení.
• Automatizace přípravy vzorků pro vysokoprůtokové výzkumné i klinické laboratoře.
• Vývoj nových makrocyklických CSP s vyšší selektivitou a odolností vůči složitým matricím.

Závěr

Studie potvrdila, že makrocyklické glykosidické stacionární fáze (CHIROBIOTIC T) pracují v reverzní fázi s vysokou selektivitou pro enantiomerní analýzu β-blokátorů.
Kombinace s HybridSPE-PPT přináší čisté vzorky bez interferencí fosfolipidů a umožňuje robustní, rychlou a kvantitativní LC-MS analýzu biologických matric.

Reference

Aurand C. R., Brandes H. K., Bell D. S., Way W., Santasania C. T. Utilizing Enantiomeric Separations in Bioanalysis. Supelco, Div. of Sigma-Aldrich.