An LC-MS/MS Clinical Research Method for the Measurement of 25-OH Vitamin D2and D3 Metabolites

Význam tématu

Vitamin D hraje zásadní roli v regulaci vápníku a imunitních funkcích. Jeho nedostatek je spojen s řadou onemocnění včetně osteoporózy, některých typů rakoviny a metabolických poruch. Přesné stanovení plazmatických hladin 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 je proto klíčové pro klinický výzkum i kvalitu péče o pacienty.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ověřit, že kombinace online SPE modulu s ultrarychlou kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií umožňuje citlivé, specifické a reprodukovatelné stanovení 25-OH D2 a 25-OH D3 v lidské plazmě. Studie porovnala novou metodiku s existujícím LC-MS/MS postupem a hodnotila variabilitu i korelaci výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek 150 µl plazmy byl proteiny precipitován pomocí ZnSO4 a doplněn izotopově značenými interními standardy. Extrakce proběhla online na MassTrak C8 kartridži vestavěném v ACQUITY UPLC Online SPE Manageru. Chromatografie byla prováděna na ACQUITY UPLC CSH Phenyl-Hexyl kolonce (1,7 µm, 2,1×100 mm) při teplotě 35 °C. Detekce ve dvojitém kvadrupólu Xevo TQ-S probíhala v režimu víceknízkého monitorování (MRM). Optimalizované gradienty a SPE kroky zajišťují plné očištění a rozlišení vitaminových forem během 6 minut.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala kvalitní separaci 25-OH D2 a 25-OH D3 s odchylkami intra- i inter-sériové variability pod 5 %. Typické plazmatické úrovně 55 nmol/l pro D3 a 14 nmol/l pro D2 byly spolehlivě měřeny při nízkém šumu. Porovnání s referenčním LC-MS/MS postupem ukázalo vynikající korelaci (Demingova regrese 1,08×+1,25), přičemž nový workflow zkracuje čas přípravy a zvyšuje efektivitu práce.

Přínosy a praktické využití metody

Nový protokol nabízí:

• Simultánní kvantifikaci 25-OH D2 a D3 při nízkých nmol/l koncentracích
• Integrovanou online SPE přípravu vzorku v automatickém režimu
• Rychlou analýzu do šesti minut na vzorek
• Minimální objem plazmy (150 µl)
• Vysokou opakovatelnost a robustnost v diagnostické a výzkumné laboratoři

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat rozšíření panelu vitamínových metabolitů, implementaci do vysoko-propustných klinických platforem a integraci s bioinformatickými nástroji pro personalizovanou medicínu. Automatizace a miniaturizace by mohly dále zkrátit dobu analýzy a snížit náklady.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda s ACQUITY UPLC OSM představuje efektivní, citlivý a robustní nástroj pro rutinní stanovení 25-OH vitaminu D2 a D3 v plazmě. Díky integrované automatizaci a vysoké reprodukovatelnosti nachází široké uplatnění v klinickém výzkumu i v laboratořích QA/QC.

Reference

• van Faassen M, Kema I, Graham K An LC-MS/MS Clinical Research Method for the Measurement of 25-OH Vitamin D2 and D3 Metabolites Waters Corporation Application Note 2015