Evaluation of Alternative Ion-pairing Reagents in the Analysis of Oligonucleotides with the ACQUITY QDa Detector

Význam tématu

Analýza syntetických oligonukleotidů s modifikovanými bázemi vyžaduje spolehlivé chromatografické a hmotnostně-spektrometrické techniky pro kvalitativní i kvantitativní stanovení. Ion-párovaná reverzní fáze (IP-RPLC) s kombinací triethylaminu (TEA) a hexafluoroisopropanolu (HFIP) se osvědčila jako standard pro dosažení vysoké separační účinnosti a citlivosti v MS detekci. Vzhledem k novým oligonukleotidům s různými fyzikálně-chemickými vlastnostmi je však žádoucí ověřit alternativní ion-párovací činidla, která umožní optimalizaci retence, selektivity, nákladů a životnosti chromatografických kolon.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkon butylaminu (BA) a dibutylaminu (DBA) jako náhrad TEA v kombinaci s HFIP při analýze polyT oligonukleotidů a jednovláknové RNA (21 nt). Hodnocena byla chromatografická selektivita, citlivost ACQUITY QDa detektoru, opakovatelnost, životnost kolony a komparabilita metod na standardech o délkách 15–35 nukleotidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém: ACQUITY UPLC H-Class se sloupcem Oligonucleotide BEH C18 (2,1×50 mm, 1,7 µm), kolona 60 °C, injekční objem 5 µl.
• Detekce: ACQUITY UPLC TUV (260 nm) a ACQUITY QDa Mass Detector v negativním režimu, rozsah 410–1250 Da, vzorkovací rychlost 2 body/s.
• Mobilní fáze: A: 15 mM TEA (pH 8,0), 400 mM HFIP; A: 15 mM BA (pH 9,0), 50 mM HFIP; A: 15 mM DBA (pH 9,5), 25 mM HFIP. Organická složka: methanol.
• Software: MassLynx SCN 9.25 s MaxEnt dekonvolucí.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání TEA:HFIP, BA:HFIP a DBA:HFIP na standardní sadě polyT prokázalo srovnatelnou selektivitu pro BA a mírně změněné chromatografické podmínky pro DBA. Citlivost MS detekce byla u BA podobná jako u TEA a u DBA přibližně poloviční, přesto dostatečná pro detekci N-1 nežádoucích produktů. Studie životnosti kolony při pH 9,0 a 60 °C během 200 hodin / 400 injekcí ukázala stabilní retence a selektivitu (RSD <1 %). Inter-assay variabilita retenčního času a šířky píků W50 činila ≤1,7 % a ≤1,5 %, což dokládá vysokou robustnost metody. Separace 21nt ssRNA ukázala u BA:HFIP obdobné rozlišení hlavního cílového píku od N-1 a N+1 nečistot a obdobnou QDa odezvu (1,43 vs. 1,68×10^8 A.U.) jako u TEA:HFIP.

Přínosy a praktické využití metody

• Alternativní ion-párovací činidla (BA, DBA) umožňují snížení spotřeby HFIP a tím nákladů metody.
• Metoda je plně kompatibilní se stávajícími ACQUITY QDa workflow a Waters OST kolony.
• Zachována je vysoká selektivita, citlivost a robustnost i při zvýšeném pH a teplotě.

Budoucí trendy a možnosti využití

S rozšířením terapeutických oligonukleotidů lze očekávat další optimalizaci ion-párovacích systémů, zkoumání různých amínů a modulaci gradientů. Integrace vícesložkových detekcí (UV, MS) a automatizace přípravy vzorků zvýší throughput a kvalitu dat. Vývoj kolagenních materiálů a modifikovaných fází kolony pro specifickou retenci modifikovaných bází představuje další směr výzkumu.

Závěr

Studie prokázala, že butylamin a dibutylamin v kombinaci s HFIP jsou životaschopnou alternativou k triethylaminu pro IP-RPLC/MS analýzu oligonukleotidů. BA:HFIP nabízí srovnatelnou selektivitu, citlivost a prodlouženou životnost kolony při nižších nákladech. Metoda je robustní, flexibilní a snadno integrovatelná do existujících workflow s ACQUITY QDa detektorem.

Reference

• 1. Apffel A, Chakel JA, Fischer S, Lichtenwalter K, Hancock WS. Analysis of oligonucleotides by HPLC-electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 1997;69(7):1320–1325.
• 2. Apffel A, Chakel JA, Fischer S, Lichtenwalter K, Hancock WS. New procedure for the use of high-performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry for the analysis of nucleotides and oligonucleotides. J Chromatogr A. 1997;777(1):3–21.
• 3. McGinnis AC, Chen B, Bartlett MG. Chromatographic methods for the determination of therapeutic oligonucleotides. J Chromatogr B. 2012;883–884:76–94.
• 4. Gong L, McCullagh JSO. Comparing ion-pairing reagents and sample dissolution solvents for ion-pairing reversed-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry analysis of oligonucleotides. Rapid Commun Mass Spectrom. 2014;28(4):339–350.
• 5. Waters Corporation. High-throughput screening of oligonucleotides for identity and purity assessment using the ACQUITY QDa detector and ProMass for MassLynx. Application Note. 2016;720005681EN.
• 6. Waters Corporation. Adding mass detection to synthetic oligonucleotide analyses with the ACQUITY QDa detector. Application Note. 2016;720005632EN.
• 7. Gilar M. Analysis and purification of synthetic oligonucleotides by reversed-phase high-performance liquid chromatography with photodiode array and mass spectrometry detection. Anal Biochem. 2001;298:196.
• 8. Gilar M, Fountain KJ, Budman Y, Neue UD, Yardley KR, Rainville PD, Russell RJ II, Gebler JC. Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides: retention prediction. J Chromatogr A. 2002;958:167.