High-throughput Screening of Oligonucleotides for Identity and Purity Assessment Using the ACQUITY QDa Detector and ProMass for MassLynx

Význam tématu

Oligonukleotidy se staly klíčovými molekulami v oblasti terapeutických aplikací DNA/RNA pro cílenou léčbu. Spolehlivá a rychlá identifikace jejich identity a čistoty je nezbytná pro zajištění účinnosti a bezpečnosti bioterapeutických produktů. Metody kombinující kapalinovou chromatografii s hmotnostní detekcí umožňují detailní charakterizaci sekvencí i jejich vedlejších produktů.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl demonstrovat kompatibilitu detektoru ACQUITY QDa s dekonvolučním softwarem ProMass (MassLynx) pro vysokoprůtočnou analýzu syntetických oligonukleotidů. Autoři představují pracovní postup integrující iontově párovanou RP-UPLC metodiku s ESI hmotnostní detekcí pro rychlou kontrolu identity a čistoty oligonukleotidů.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza byla prováděna na systému ACQUITY UPLC H-Class s reversní fází BEH C18 kolony (1,7 µm, 2,1×50 mm). Detekce probíhala současně UV při 260 nm a hmotnostním detektorem ACQUITY QDa v režimu ESI negativní, rozsah 410–1250 Da. Pro dekonvoluci surových spekter byl použit MaxEnt1 algoritmus v MassLynx SCN 9.25 a ProMass HR s algoritmem ZNova. Mobilní fáze obsahovaly triethylamin a hexafluoroizopropanol v H2O a metanolu, pH 8, gradienty optimalizované pro standardy polyT i siRNA.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizované dekonvoluce polyT standardů prokázaly vysokou reprodukovatelnost s odchylkami mezi –0,1 a +0,5 Da. U modelové siRNA sekvence délky 21 nukleotidů byly jednoznačně rozlišeny formy N-1, N a N+1 s chybou do ±0,4 Da během deseti minut. Integrace ProMassBridge umožnila dávkové zpracování až 48 vzorků současně s interaktivním webovým výstupem, kde barevně odlišené výsledky usnadňují rychlou kontrolu a validaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysokoprůtočná analýza: automatizované dávkové zpracování zkracuje dobu analýzy.
• Spolehlivá identifikace: přesná hmotnostní data pro potvrzení cílové sekvence a odhalení vedlejších produktů.
• Interaktivní reporting: webové rozhraní zjednodušuje prohlížení výsledků a umožňuje detailní kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s HRMS systémy pro ještě vyšší rozlišení modifikací.
• Rozšíření do QA/QC procesů v biotechnologickém průmyslu.
• Využití strojového učení pro predikci a rozpoznání vzácných nečistot.

Závěr

Propojení detektoru ACQUITY QDa a dekonvolučního softwaru ProMass představuje efektivní, nákladově úsporné a plně automatizovatelné řešení pro hodnocení identity a čistoty syntetických oligonukleotidů. Metoda nabízí vysokou přenositelnost do rutinní produkce a podporuje rychlý vývoj nových bioterapeutik.

Reference

1. Agrawal S., Zhao Q. Antisense therapeutics. Current Opinion in Chemical Biology. 1998;2(4):519–528.
2. McGinnis A.C., Chen B., Bartlett M.G. Chromatographic methods for the determination of therapeutic oligonucleotides. Journal of Chromatography B. 2012;883–884:76–94.
3. Apffel A., Chakel J.A., Fischer S., Lichtenwalter K., Hancock W.S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-ESI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 1997;69(8):1320–1325.
4. Apffel A., Chakel J.A., Fischer S., Lichtenwalter K., Hancock W.S. New procedure for the use of HPLC-ESI MS for nucleotides and oligonucleotides. Journal of Chromatography A. 1997;777(1–2):3–21.
5. Ivleva V., McCarthy S., Yu Y., Gilar M. ProMass for MassLynx Software for Oligonucleotides Analysis. Waters Application Note. 2010;720003577EN.
6. Birdsall R., McCarthy S. Increasing Specificity and Sensitivity in Routine Peptide Analyses Using Mass Detection with the ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note. 2015;720005377EN.
7. Cosgrave E., Birdsall R., McCarthy S. Rapidly Monitoring Released N-Glycan Profiles During Process Development Using RapiFluor-MS and the ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note. 2015;720005438EN.
8. Birdsall R., McCarthy S. Adding Mass Detection to Routine Peptide-Level Biotherapeutic Analyses with the ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note. 2015;720005266EN.
9. Birdsall R., Qing Yu Y. Adding Mass Detection to Synthetic Oligonucleotide Analyses with the ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note. 2016;720005632EN.