Adding Mass Detection to Synthetic Oligonucleotide Analyses with the ACQUITY QDa Detector

Význam tématu

Analýza syntetických oligonukleotidů je klíčová pro vývoj terapeutických nukleových kyselin, jako jsou antisense DNA a RNA interferenční molekuly. Přidání informací o hmotnostech k tradičním IP-RPLC metodám zvyšuje specifitu a urychluje identifikaci modifikací báze, což napomáhá optimalizaci výrobních procesů a zajištění kvality finálních léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikacní poznámky bylo ověřit, že detektor ACQUITY QDa lze snadno a nákladově efektivně integrovat do stávajících UV-based LC workflow pro analýzu oligonukleotidů o délce 15–35 nukleotidů. Studie použila standardy polyT, mobilní fáze s ion-pairingovými činidly TEA a HFIP a vyhodnotila přesnost, reprodukovatelnost a kompatibilitu detektoru.

Použitá instrumentace

• UPLC systém: ACQUITY UPLC H-Class
• UV detektor: ACQUITY UPLC TUV s Ti flow cell
• Mass detektor: ACQUITY QDa s negativním režimem
• Kolona: ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18, 2.1×50 mm, 1.7 μm
• Software: MassLynx SCN 9.25 s MaxEnt1 dekonvolučním algoritmem
• Mobilní fáze: 15 mM TEA/400 mM HFIP ve vodě (A) a v methanolu (B)

Hlavní výsledky a diskuse

Serialní konfigurace UV a QDa detektoru prokázala vysokou korelaci mezi chromatogramy. QDa detektor detekoval u všech standardů více nábojových stavů (5–9 stavů), přičemž intenzita signálu klesala u kratších sekvencí kvůli omezenému m/z rozsahu. Přesnost měření m/z pro jednotlivé nábojové stavy byla v technické trojici v rozmezí ±0,2 Da a RSD ≤0,02 %. Dekonvoluční algoritmus MaxEnt1 umožnil převést multi-charge spektra na jednovrcholovou hmotnost s odchylkou do +0,7 Da od teoretické hodnoty a detekcí sodných aduktů (<6 % intenzity).

Přínosy a praktické využití metody

• Nasazení stávajících IP-RPLC metod obohacených o hmotnostní údaje bez složitých změn workflow
• Vzájemná komplementarita UV a MS detekce zvyšuje jistotu identifikace a purity kontrolu
• Rychlejší lokalizace a potvrzení modifikovaných báze v terapeutických oligonukleotidech
• Vysoká reproducibilita a dostatečná přesnost pro rutinní QC a procesní monitorování

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší aplikace QDa detektoru na analýzu různých třídy biopolymérů, včetně mRNA vakcín a glykokonjugátů
• Automatizovaná dekonvoluce a reportování hmotnostních dat pro vyšší throughput
• Integrace dalších ortogonálních detekčních principů, např. fluorescence či osvětlení intracelulárních analytů
• Vývoj nových ion-pairingových systémů optimalizovaných pro MS detekci

Závěr

Studie potvrdila, že detektor ACQUITY QDa lze jednoduše integrovat do standardních IP-RPLC postupů pro syntetické oligonukleotidy a získávat přesná, reprodukovatelná hmotnostní data. Tato kombinace UV a MS detekce výrazně zlepšuje produktivitu a spolehlivost rutinních QC analýz v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu.

Reference

1. Birdsall R., McCarthy S. Increasing Specificity and Sensitivity in Routine Peptide Analyses Using Mass Detection with the ACQUITY QDa Detector. 2015;720005377en.
2. Cosgrave E., Birdsall R., McCarthy S. Rapidly Monitoring Released N-Glycan Profiles During Process Development Using RapiFluor-MS and the ACQUITY QDa Detector. 2015;720005438en.
3. Birdsall R., McCarthy S. Adding Mass Detection to Routine Peptide-Level Biotherapeutic Analyses with the ACQUITY QDa Detector. 2015;720005266en.
4. Agrawal S., Zhao Q. Antisense therapeutics. Current Opinion in Chemical Biology 1998;2:519–28.
5. McGinnis A.C., Chen B., Bartlett M.G. Chromatographic methods for the determination of therapeutic oligonucleotides. Journal of Chromatography B 2012;883–884:76–94.
6. Apffel A., Chakel J.A., Fischer S., Lichtenwalter K., Hancock W.S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC−Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry 1997;69:1320–5.
7. Apffel A., Chakel J.A., Fischer S., Lichtenwalter K., Hancock W.S. New procedure for the use of high-performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry for the analysis of nucleotides and oligonucleotides. Journal of Chromatography A 1997;777:3–21.