Developing a Novel, Integrated LC-MS Workflow for High-resolution Monitoring and Characterization of Oligonucleotides

Význam tématu

Vývoj spolehlivých analytických postupů pro charakterizaci a kvantifikaci oligonukleotidových terapeutik je klíčový pro zajištění jejich bezpečnosti, účinnosti a kvality. V praxi jsou nezbytné metody umožňující přesné stanovení molekulové hmotnosti, detekci nesprávně syntetizovaných sekvencí a monitorování produktových nečistot v biologických vzorcích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout integrovaný LC-MS workflow využívající vysokorozlišovací QTof spektrometr Xevo G2-XS a UPLC systém ACQUITY H-Class Bio pro detailní sledování oligonukleotidů. Workflow kombinuje chromatografickou separaci, UV detekci a MS/MS analýzu s automatizovanou dekonvolucí spekter a řízenou identifikací pomocí softwaru MassLynx a ProMass HR.

Použitá metodika

Veškeré mobilní fáze byly připraveny gravimetricky s 15 mM TEA a 400 mM HFIP v H2O či v methanolu. Pomocí Waters Oligonucleotide BEH C18 kolony při teplotě 60 °C a gradientu organické fáze bylo dosaženo rozdílných podmínek pro mix polyT standardů i jednotlivé ssRNA vzorky. MS měření v negativním modu s rozsahy m/z 400–3000 Da a volty pro konickou desku 80 V (MS) a 120 V (MS/MS) zajistily vysoce kvalitní spektra. Data byly získávány v MassLynx a následně dekonvolvovány a vyhodnoceny v ProMass HR.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• ACQUITY UPLC Tunable UV Detector (260 nm)
• Xevo G2-XS QTof Mass Spectrometer
• MassLynx v.4.1 s moduly MaxEnt1/3
• ProMass HR (Novatia) a ProMass Bridge 1.1

Hlavní výsledky a diskuse

Separace polyT oligonukleotidů (15–35 nt) prokázala vynikající rozlišení a minimální intenzitu sodných aduktů (<5 %). Monozstitická hmotnost všech pěti oligomerů vykázala průměrnou přesnost 1,24 ppm. Limit detekce pro MassPREP OST standard byl 20 fmol na kolonu, přičemž LOD je omezen UV signálem. Automatizovaná tvorba HTML reportů s barevným vyznačením detekovaných vzorků výrazně zjednodušuje průběžnou kontrolu kvality. MS/MS s rozkladovým napětím 35 V umožnilo plné „ladder“ sekvenování 21 nt ssRNA, kdy byly identifikovány a přiřazeny všechny cílené fragmenty.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený workflow nabízí komplexní řešení pro:

• rychlou identifikaci a kvantifikaci oligonukleotidových produktů
• monitorování syntézních nečistot (N-1, N+1)
• automatizovanou dekonvoluci a generování přehledných HTML reportů
• potvrzení sekvence pomocí MS/MS full ladder fragmentace

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na zvýšení propustnosti, rozšíření databází fragmentačních vzorů, integraci umělé inteligence pro pokročilou interpretaci výsledků a adaptaci na nové typy chemických modifikací oligonukleotidů. Vzrůstající poptávka po kvalitativní a kvantitativní kontrole terapeutických RNA/oligonukleotidů bude stimulovat inovace ve spektrometrii a softwarové automatizaci analýzy.

Závěr

Integrovaný LC-MS workflow s využitím ACQUITY UPLC H-Class Bio a Xevo G2-XS QTof v kombinaci s MassLynx a ProMass HR poskytuje vysoce přesný, citlivý a automatizovaný postup pro monitorování, charakterizaci a potvrzení sekvence oligonukleotidů. Metoda je vhodná pro výzkum, vývoj i rutinní QC analýzy.

Reference

1. Routine LC-MS Analysis of Intact Antibodies. Waters Application Note. 2015. (P/N 720005557EN)
2. High Sensitivity Intact Mass Analysis of Antibodies (IgG1) Using ionKey/MS. Waters Application Note. 2015. (P/N 720005378EN)
3. A Streamlined Data Dependent Acquisition (DDA) Peptide Mapping Workflow for Characterizing Therapeutic Proteins Using the Biopharmaceutical Platform Solution with UNIFI. Waters Application Note. 2015. (P/N 720005399EN)
4. Biopharmaceutical Platform Solution with UNIFI: A Holistic Workflow for Acquiring, Processing, and Reporting Fluorescent-Labeled Glycans. Waters Application Note. 2016. (P/N 720004619EN)
5. Adding Mass Detection to Synthetic Oligonucleotide Analyses with the ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note. 2016. (P/N 720005632EN)
6. High-throughput Screening of Oligonucleotides for Identity and Purity Assessment Using the ACQUITY QDa Detector and ProMass for MassLynx. Waters Application Note. 2016. (P/N 720005681EN)