Improving Detection of Anabolic Steroids in Sports: Simultaneous Detection of Intact Phase I and Phase II Urinary Metabolites by UPLC-MS/MS

Význam tématu

Anabolické androgenní steroidy představují nejčastěji zneužívané dopinové látky ve sportu. Jejich včasná a spolehlivá detekce v moči sportovců je nezbytná pro dodržování zásad fair play a pro ochranu zdraví sportovců. Tradiční screeningové postupy založené na GC-MS nebo LC-MS/MS po enzymatické hydrolýze detekují pouze volné a hydrolyzovatelné glukuronokoniugáty, zatímco stabilní sulfátové či některé glukuronidové konjugáty zůstávají nepovšimnuty.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout rychlou a citlivou UPLC-MS/MS metodu umožňující simultánní analýzu intaktních metabolitů fáze I i fáze II (glukuronidů i sulfátů) v močových vzorcích bez nutnosti hydrolýzy či derivačních úprav. Studie zahrnovala optimalizaci chromatografických i hmotnostních podmínek, validaci metody z hlediska LOD, recovery, přesnosti a matričních efektů a aplikaci na vzorky po orální aplikaci methyltestosteronu a stanozololu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moči byly připraveny jednoduchou SPE extrakcí na C18 kazetách bez hydrolýzy. Po nanesení interních standardů a průchodu kartridou byla frakce analyzátů eluována methanolem, vysušena a rekonstituována v ACN: voda (10:90). Analýza probíhala na ACQUITY UPLC systému se sloupcem BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 µm) při 45 °C a plynulém gradientu formiátového pufru/ACN. Detekce probíhala na Xevo TQ MS v módech ESI+ a ESI– s MRM akvizicí.

• ACQUITY UPLC System
• Xevo TQ MS
• ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×100 mm, 1.7 µm
• Sep-Pak Vac RC C18 500 mg kazety
• MassLynx v4.1

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace MRM přechodů umožnila vybrat vysoce selektivní fragmentační kanály pro 23 steroidních metabolitů. LOD se pohybovaly v rozmezí 0,25–4 ng/mL pro většinu látek, recovery přes 77 % a intradenní přesnost do 21 %. Matriční efekty zůstaly mezi 92 a 147 %. Aplikace na exkreční studie ukázala významné prodloužení detekčního okna:

• Metabolit methyltestosteronu METm3-S detekovatelný až 23 dnů oproti 4–6 dnům metodou GC-MS.
• Dlouhodobé stanozololové glukuronidy (např. eSTAN-N-G) detekovatelné až 21 dnů bez hydrolýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Simultánní detekci intaktních fází I i II bez hydrolýzy či derivačních kroků.
• Zvýšení detekčního okna díky monitoringu stabilních sulfátových a glukuronidových konjugátů.
• Snadnou implementaci nových metabolitů do MRM metody.
• Potenciál plné automatizace s on-line SPE.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je rozšíření panelu sledovaných fáze II metabolitů, nasazení vysokého rozlišení a přesné hmotnostní spektrometrie pro neznámé markery a integrace on-line extrakčních technologií pro plně automatizované workflow v akreditovaných antidopingových laboratořích.

Závěr

Navržená UPLC-MS/MS screeningová metoda významně zlepšuje spolehlivost a dobu detekce anabolických steroidů v moči sportovců. Eliminací enzymatické hydrolýzy a zaměřením na intaktní fáze I i II metabolity se rozšiřuje detekční okno a zjednodušuje analytický postup, což přispívá k efektivnějšímu boji proti dopingu.

Reference

• World Antidoping Agency. 2013 Adverse Analytical Findings and Atypical Findings Reported by Accredited Laboratories.
• Gomez C, Fabregat A, Pozo OJ, Marcos J, Segura J, Ventura R. Analytical strategies based on mass spectrometric techniques for the study of steroid metabolism. TrAC Trends Anal Chem. 2013;53:106.
• Balcells G, Pozo OJ, Esquivel A, Kotronoulas A, Joglar J, Segura J, Ventura R. Screening for anabolic steroids in sports: analytical strategy based on the detection of phase I and phase II intact urinary metabolites by liquid chromatography tandem mass spectrometry. J Chromatogr A. 2015;1389:65.
• Gomez C, Pozo OJ, Geyer H, Segura J, Ventura R. New potential markers for the detection of boldenone misuse. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012;132:239.
• Gomez C, Pozo OJ, Marcos J, Segura J, Ventura R. Alternative long-term markers for the detection of methyltestosterone misuse. Steroids. 2013;78:44.
• Gomez C, Pozo OJ, Garrostas L, Segura J, Ventura R. A new sulphate metabolite as a long-term marker of metandienone misuse. Steroids. 2013;78:1245.
• Schanzer W, Guddat S, Thomas A, Opfermann G, Geyer H, Thevis M. Expanding analytical possibilities concerning the detection of stanozolol misuse by means of high resolution/high accuracy mass spectrometric detection of stanozolol glucuronides in human sports drug testing. Drug Test Anal. 2013;5:810.