Detection of Stanozolol Glucuronides in Human Sports Drug Testing by Meansof High-Resolution, Accurate-MassMass Spectrometry

Význam tématu

Detekce glukuronidů stanozololu v moči je klíčová pro spolehlivé odhalení zneužívání anabolických steroidů ve sportu. Metoda založená na kapalinové chromatografii s vysokým rozlišením a přesnou hmotností (LC-HRMS) umožňuje dosáhnout nízkých hraničních hodnot detekce a prodlouženého detekčního okna díky identifikaci primárních i dlouhodobých metabolitů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat aplikaci přímé analýzy „dilute-and-shoot“ glukuronidů stanozololu pro rutinní antidopingové testy. Hlavní body:

• charakterizace 3’-OH-stanozolol-glukuronidu,
• validace počátečního screeningu a potvrzovacích postupů,
• vyhledání a sledování nových dlouhodobých metabolitů.

Použitá metodika

Vzorky moči od dvou dobrovolníků po perorální dávce 5 mg stanozololu byly odebírány až 28 dní. Pro screening stačilo 90 µl moči zředěných acetonitrilem s interním standardem methyltestosteronem (1 µg/ml), bez další extrakce. Potvrzovací postup zahrnoval SPE extrakci (voda/methanol), sušení extraktu a znovu rozpouštění v roztoku 0,1 % kyseliny mravenčí a acetonitrilu (1:1).

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf Thermo Scientific Accela 1250 s analytickou kolonkou C18 (50 × 2 mm, 1,8 µm) a prekolonkou (4 × 2 mm, 3 µm).
• Mass spektrometr Thermo Scientific Q Exactive Focus s HESI-II zdrojem.
• Gradientní eluce mobilními fázemi 0,1 % kyseliny mravenčí (A) a acetonitrilu (B) při 200 µl/min: z 99 % A na 100 % B za 7 min.
• Režimy měření: Full Scan m/z 100–1000 (rozlišení 35 000 FWHM) a PRM s izolací iontů m/z 505,25 a 521,25.

Hlavní výsledky a diskuse

Byly identifikovány dva primární glukuronidy stanozololu (O- a N-glukuronid), potvrzené enzymatickou hydrolyzí. Dále se objevil dlouhodobý metabolit 16-oxo-stanozolol s charakteristickou ztrátou C2H6. Farmakokinetika exkrece ukázala, že 17-epistanozolol-N-glukuronid lze detekovat až 28 dní po aplikaci. Validované parametry: LOD 20 pg/ml (screening), 5 pg/ml (potvrzení), specifita bez rušivých signálů v 10 zdravých vzorcích, lineární oblast 25–250 pg/ml, inter- a intradení CV < 16 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost a delší detekční okno díky využití glukuronidů a dlouhodobých metabolitů.
• Rychlá a jednoduchá příprava vzorku pro screening („dilute-and-shoot“).
• Spolehlivá potvrzovací analýza s SPE extrakcí umožňující jednoznačnou identifikaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj izotopově značených standardů pro detailnější lokalizaci pozice glukuronidace.
• Aplikace LC-HRMS na další anabolické steroidy a jejich nově objevené dlouhodobé metabolity.
• Integrace detekce nových markerů do standardních antidopingových protokolů pro zlepšení odolnosti vůči manipulaci.

Závěr

Studie prokázala, že LC-HRMS metoda s přímou analýzou glukuronidů stanozololu je účinným nástrojem pro dlouhodobé sledování zneužívání tohoto steroidu ve sportu. Kombinuje vysokou citlivost, rychlou přípravu vzorku a robustní potvrzovací postup.

Reference

1. Schänzer W.; Guddat S.; Thomas A.; Opfermann G.; Geyer H.; Thevis M. Expanding analytical possibilities concerning the detection of stanozolol misuse by means of high resolution/high accuracy mass spectrometric detection of stanozolol glucuronides in human sports drug testing. Drug Test Anal. 2013, 5(11-12), 810-818.
2. Mareck U.; Geyer H.; Opfermann G.; Thevis M.; Schänzer W. Factors Influencing the Steroid Profile in Doping Control Analysis. J. Mass Spectrom. 2008, 43, 877-891.