Analysis of Multiclass Steroids in Serum Using Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Endogenní steroidy hrají klíčovou roli v řadě fyziologických procesů a jejich přesné stanovení v plazmě či séru je zásadní pro klinické výzkumy i diagnostiku. Tracní koncentrace a strukturní podobnost mezi jednotlivými sloučeninami často vedou k nespecifickým výsledkům u imunoanalýz. Metody založené na LC/MS/MS nabízí výrazně vyšší specificitu, citlivost a multiplexní měření více steroidů najednou.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout rychlý a reprodukovatelný workflow pro kvantitativní stanovení 15 steroidů v lidském séru. Kombinace automatizovatelné podpůrné extrakce kapalina–kapalina (SLE) v 96-jamkových destičkách a chromatografie spojené s třetí kvadrupólovou detekcí (Ultivo TQ) umožňuje vysokou propustnost vzorků, citlivé rozlišení a přesné kvantifikace s nízkými detekčními limity.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla použita destička Agilent Chem Elut S (2 mL, 96 well) na podporovanou kapalinnou extrakci s použitím směsi ethylacetát/MTBE. Vzorky (350 µL séra + interní standardy) byly zpracovány na pozitivním tlakovém manifoldu PPM-96 a eluát byl rekoncentrován v 60 µL dithilizátu. Chromatografická separace proběhla na Agilent 1260 Infinity II LC s kolonou Poroshell 120 EC-C18 (3 × 50 mm, 2,7 µm) při 45 °C a gradientu vody/methanolu s 0,5 mM ammonium fluoridu v čase 0–14 min. Detekce byla realizována na Agilent Ultivo LC/TQ se zdrojem AJS a režimem MRM. Optimalizace MRM přechodů, fragmentorového napětí a kolizních energií proběhla softwarově v MassHunter Optimizeru.

Hlavní výsledky a diskuse

SLE extrakce zajistila efektivní odstranění proteinů a fosfolipidů s výtěžností 82–112 %. Celková doba chromatografické analýzy je 14 min, chromatografické rozlišení dovolilo jednoznačné oddělení i strukturálně podobných párů (např. 11-deoxycortisol vs. 21-deoxycortisol). Detekční limity (MDL) se pohybují v rozmezí 8–43 528 ng/L, linearita byla potvrzena pro všech 15 analytů v rozsahu L1–L6 s R² > 0,995. Opakovatelnost retence byla < 0,5 %RSD, plošné odpovědi < 10 %RSD. Mezidenní reprodukovatelnost opakovaných příprav QC vzorků (LQC/MQC/HQC) byla < 10 %RSD.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: 96-jamkové destičky a automatizace zkracují čas přípravy.
• Nízká spotřeba vzorku: pouhých 350 µL séra.
• Široké spektrum stanovených analytů: simultánně 15 steroidů.
• Vysoká specificita: MRM přechody minimalizují interferenci.
• Robustnost a reprodukovatelnost: vhodné pro rutinní klinické a výzkumné laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je rozšíření panelu analyzovaných biomarkerů (aminokyseliny, peptidy), integrace s plně automatizovanými platformami a využití strojového učení pro pokročilou analýzu dat. Vývoj ultrarychlých kolón, nových ionizačních technik a miniaturizovaných přístrojů podpoří nasazení v POCT (Point-of-Care Testing).

Závěr

Workflow založený na SLE destičkách a Agilent Ultivo LC/TQ umožňuje citlivou, selektivní a rychlou kvantifikaci 15 steroidů z malého objemu séra. Metoda prokázala výbornou linearitu, přesnost a reprodukovatelnost, což ji předurčuje k použití v klinické výzkumné praxi i průmyslové kvalitativní kontrole.

Reference

1. Greaves RF, et al. A Guide to Understanding the Steroid Pathway: New Insights and Diagnostic Implications. Clinical Biochemistry. 2014;47:5–15.
2. Ketha H, et al. Clinical Applications of LC/MS Sex Steroid Assays: Evolution of Methodologies in the 21st Century. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 2014;21:217–226.
3. Couchman L, et al. Challenges and Benefits of Endogenous Steroid Analysis by LC/MS/MS. Bioanalysis. 2011;3(22):2549–2572.