A Refined LC/MS/MS Method Targeting Bile Acids from the Gut Microbiome

Význam tématu

Metabolity žlučových kyselin produkované střevní mikrobiotou představují klíčový modulátor hostitelské fyziologie i energetického metabolismu. Přesný profil žlučových kyselin a jejich izomerů má význam pro studium střevní rezonance, patofyziologie jaterních onemocnění i výzkum léčiv. Cílené stanovení těchto látek vyžaduje robustní, citlivou a selektivní analytickou metodu s minimálními nároky na složitou přípravu vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat LC/MS/MS metodu pro detekci a kvantifikaci 26 primárních, sekundárních a konjugovaných žlučových kyselin. Metoda kombinuje chromatografii s unikátním mobilním fázovým systémem na bázi acetonu a vody a selektivní detekci na trojitém kvadrupólu s dynamickou akvizicí MRM (dMRM). Důraz byl kladen na rozlišení strukturálních izomerů, potlačení lipidových interferencí a dlouhodobou stabilitu analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: proteinová srážka metanolem, homogenizace mlýnskými kuličkami, dvojí centrifugace a ředění do 50/50 metanol / voda.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II LC se sloupci Poroshell 120 EC-C18 (2,1×150 mm, 2,7 µm) a Fast Guard (2,1×5 mm), teplota 45 °C, gradient 32–100 % acetonu v mobilní fázi B, průtok až 1 000 µl/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS s Agilent Jet Stream, režim pozitivního a negativního iontování, dynamická MRM pro 84 přechodů, Q1/Q2 rozlišení 0,7 amu.
• Softwarové prostředí: Agilent MassHunter Quantitative Analysis v10.2 pro kvantifikaci a Agilent MPP v15.1 s modulem Pathway Architect pro vizualizaci dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické rozlišení: 24/26 cílených látek s bazálním oddělením izomerů, selektivní eluce lipidů (PC, TAG) při vysokém procentu acetonu a zvýšeném průtoku.
• Robustnost: stabilní chromatografické topy po více než 200 injekcích, střední CV ploch MRM ~2,7 % a CV retenčních časů <0,2 %.
• Sensitivita: limity kvantifikace (LLOQ) v řádu 0,5–20 nM, koeficienty determinace R2 > 0,99, dynamický rozsah až 4,3 dekády.
• Biologická aplikace: rozdíly v koncentracích žlučových kyselin u konvenčních versus germ-free myší demonstrovaly přítomnost primárních a sekundárních kyselin jen u normální mikrobioty. Vizualizace pomocí Pathway Architect ukázala cestu 7α-dehydroxylace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou přípravu vzorku bez složitého SPE, vysokou selektivitu díky více MRM přechodům, robustnost v dlouhodobém provozu a snadnou přenositelnost na podobné LC/TQ systémy. Je vhodná pro farmaceutický výzkum, metabolomiku, QA/QC a studie interakcí host-mikrobiota.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zařazení izotopově značených interních standardů pro absolutní kvantifikaci a kompenzaci ionizačních útlumů.
• Optimalizace přípravy vzorků pomocí MWCO filtrací či alternativních precipitací ke zlepšení čistoty extraktů.
• Rozšíření kroků automatizace a miniaturizace pro vysokokapacitní screening.
• Integrace této metody s rozsáhlejšími lipidomickými a proteomickými pracovními postupy.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda umožňuje selektivní, citlivé a reprodukovatelné profilování širokého spektra žlučových kyselin v komplexních biologických matricích. Jednoduchá příprava vzorku, vysoká robustnost a flexibilita akvizičních parametrů ji předurčují k použití v moderní metabolomice a farmakologii.

Reference

1. Devlin A. S., Fischbach M. A. A Biosynthetic Pathway for a Prominent Class of Microbiota-Derived Bile Acids. Nature Chemical Biology 2015, 11, 685–690.
2. Wegner K. et al. Rapid Analysis of Bile Acids in Different Biological Matrices Using LC-ESI-MS/MS for the Investigation of Bile Acid Transformation by Mammalian Gut Bacteria. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2017, 409, 1231–1245.