LC-MS/MS QUANTIFICATION OF INTACT INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-1 FOR CLINICAL RESEARCH

Význam tématu

Insulin–like Growth Factor-1 (IGF-1) je klíčový cirkulující protein s významnou rolí v regulaci účinků růstového hormonu. IGF-1 se používá jako doplňkový či náhradní marker pro hodnocení hladin růstového hormonu a v poslední době i k odhalování dopingu. Tradiční imunochemické metody jsou sice rozšířené, ale postrádají selektivitu vůči intactnímu proteinu a mohou vykazovat překryvy s analogickými strukturami. Implementace LC-MS/MS přináší vyšší selektivitu, citlivost a možnost přímé kvantifikace intactního proteinu v biochemických matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout jednoduchou, robustní a vysoce citlivou LC-MS/MS metodu pro přímou kvantifikaci intactního IGF-1 v biologických vzorcích. Studie zahrnovala optimalizaci extrakčního postupu, vývoj chromatografických podmínek na analytické UHPLC a nastavení tandemového kvadrupolového detektoru (MRM) pro spolehlivé dosažení LLOQ v jednotkách ng/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly zpracovány ve třech krocích:

• Disociace protein-protein komplexů: inkubace se 0,60 % SDS při 37 °C po dobu 45 min.
• Proteinová precipitace: přidání acetonitrilu (ACN), vortex, centrifugace (21 500 rpm, 10 min); ACN prokázal nejlepší výtěžnost.
• SPE clean-up: Oasis MAX µElution protokol – kondicionování MeOH a vody, vymytí 5 % NH4OH, eluční fáze MeOH:Voda:Octová kyselina (60:30:10).

Chromatografie:

• UHPLC: Waters ACQUITY UPLC I-Class, kolona CORTECS C18+ (2.1×50 mm, 1.6 µm), teplota 60 °C, vzorek při 5 °C.
• Gradient: 95 % vody (s 0.1 % kys. octové) → 95 % ACN (0–4 min) při průtoku 0.4 mL/min.

Hmotnostní spektrometrie:

• Waters Xevo TQ-XS, MRM přechody 1093 (+7) → 1196.4 a 1093 → 473.4, optimální kolizní energie a kužel napětí.
• Podmínky: desolvatace 500 °C, desolvační plyn 800 L/h, ionizační napětí 1 kV.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace extrakce ukázala, že 0,60 % SDS dokonale narušuje komplex IGF-1–IGFBP a dosahuje >90 % recovery. Proteinová precipitace s ACN byla nejúčinnější. SPE dokázala odstranit matriční interferenty. Kalibrační křivka v rozsahu 5–1000 ng/mL vykázala lineárnost r² > 0.99 (1/x vážení). LLOQ 5 ng/mL bylo robustně kvantifikovatelné, QC úrovně LQC (25 ng/mL), MQC (≈100 ng/mL) a HQC (≈600 ng/mL) měly %CV a %bias <10 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda významně zjednodušuje přípravu vzorků, eliminuje potřebu proteolytické digesce či nákladné afinitní čistění a zároveň nabízí vysokou selektivitu intactního proteinu. Vysoká citlivost v nízkých ng/mL umožňuje spolehlivou analýzu klinických a farmakokinetických studií. Surrogátní křivka na myší plazmě je použitelná pro kvantifikaci lidských vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj vysoce průtokových a multiplexových LC-MS metod, integrace automatizované extrakce a miniaturizace přípravy vzorků. Aplikace v monitoringu dopingu, pediatrii či onkologii a vyhodnocování terapeutických modulátorů IGF-1 se jeví jako perspektivní.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro intactní IGF-1 nabízí jednoduchou, rychlou a spolehlivou kvantifikaci s vynikající citlivostí a reprodukovatelností. Je ideální pro klinický výzkum a bioanalytickou praxi, kde požadujeme přesné měření v jediném kroku bez digesce.

Reference

1. Niederkofler E. E., Phillips D. A., Krastins B., Kulasingam V., Kiernan U. A., et al. Targeted Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometric Immunoassay for Insulin-like Growth Factor 1. PLoS ONE. 2013;8(11):e81125.
2. Filipe Lopes, David A. Cowan, Mario Thevis, Andreas Thomas, Mark C. Parkin. Quantification of intact human insulin-like growth factor-I in serum by nano-ultrahigh-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014;28:1426–1432.
3. Waters Corporation. Application note: LC-MS/MS Quantification of Intact Insulin-Like Growth Factor-1 for Clinical Research. 2017.