PEPTIDE AND PROTEIN BIOANALYSIS

Význam tématu

Desmopresin je syntetický analog antidiuretického hormonu s širokým klinickým využitím při léčbě diabetes insipidus a krvácení způsobeného nedostatkem von Willebrandova faktoru. Jeho farmakokinetika ve vysokých dávkách i u pediatrických pacientů si vyžaduje spolehlivou a vysoce citlivou analytickou metodu, která je schopna detekovat koncentrace ve vysokých pikogramech na mililitr.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout rychlý, vysoce selektivní a citlivý kvantitativní LC-MS/MS postup pro stanovení desmopresinu v séru potkana na úrovních nízkých desítek pikogramů na mililitr. Metoda měla být aplikovatelná v preklinických studiích a umožnit přesné vyhodnocení farmakokinetiky po podání léku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla použita dvoukroková čistící SPE extrakce:

• Předčištění: srážení proteinů acetonitrilem v poměru vzorek:organické fáze 1:2 (v/v).
• SPE očista: Oasis WCX µElution deska, která kombinuje obrácenou fázi a aniontovou výměnu, eliminující endogenní interferenty.
• Eluce: 2×25 µl eluačního roztoku (75 % acetonitril, 15 % voda, 10 % konc. NH4OH),
• Diluční krok: doplnění na 25 µl vodou,
• Injekce: 10 µl na kolonu.

Separační stupeň proběhl na chromatografu ACQUITY UPLC se sloupcem HSS T3 2.1×50 mm, 1.8 µm, při teplotě 40 °C a gradientním eluci 10–45 % organické fáze v průběhu 3,5 min při průtoku 450 µl/min. Detekce byla prováděna na tandemovém kvadrupólu Xevo TQ-S vybaveném StepWave optikou pro maximální citlivost.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný MRMraktor (535.4→328.2 m/z) vytvořil ostré, symetrické chromatografické píky velikosti 2,4 s v základně. SPE recovery se pohybovalo mezi 83–114 % pro různé koncentrace a matrice efekty byly <5 %. Metoda dosáhla LOD na úrovni ~5 pg/ml (3× S/N = 10) a dolní meze kvantifikace (LLOQ) 20 pg/ml s mezním relativním RSD <10 % a odstupem signálu od šumu >20:1. Systém StepWave zvýšil citlivost ~25× oproti konvenčnímu zdroji. Metoda byla lineární v rozsahu 0,02–10 ng/ml (r²>0,998). Inter- a intradení přesnost QC vzorků byla 92–106 % a RSD ≤7 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje rychlou (3,5min cyklus) a vysoce citlivou analýzu desmopresinu bez nutnosti imunoprecipitace.
• SPE µElution deska eliminuje potřebu sušení vzorku a minimalizuje ztráty peptidů, čímž šetří čas a materiál.
• UPLC separace na HSS T3 sloupci poskytuje dostatečnou rozlišovací schopnost od matrice při vysokém provozním průtoku.
• StepWave optika v Xevo TQ-S zajišťuje nejvyšší citlivost a umožňuje detekci nízkých pg/ml dávek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vylepšení lze očekávat integrací nanoflow či mikrofluidních technologických platforem (ionKey/MS), které umožní ještě vyšší citlivost a snížení objemu vzorku. Další rozšíření metody lze provést o více biopočtů pro komplexní farmakokinetické a biomarkerové studie. Automatizace extrakce a ucelené workflow pro velké soubory vzorků umožní vysokoproznávací preklinický screening.

Závěr

Byla vyvinuta robustní, rychlá a vysoce citlivá LC-MS/MS metoda pro stanovení desmopresinu v potkaním plazmě. Metoda dosahuje LLOQ 20 pg/ml, linearity r²>0,998 a RSD <10 %. Použití µElution SPE, UPLC a Xevo TQ-S StepWave optiky poskytuje významné zrychlení, úsporu materiálu a vysokou kvalitu dat, nezbytnou pro PK analýzy.

Reference

• Plumb RS, Rainville PD, Booth GB, Journal of Integrated Biology 2004; 5(2):209–215.
• Rainville Paul D et al., Journal of Chromatography B 2010; 878(26):2528–2536.
• Viswanathan CT et al., AAPS Journal 2007; 9(1):E109–114.
• Bansal S, DeStefano A., The AAPS Journal 2007; 9(1):E109–114.