Bioanalytical Sample Preparation and Method Development for Therapeutic and Endogenous Peptides

Význam tématu

Peptidová bioanalýza hraje klíčovou roli při vývoji terapeutických a endogenních peptidů, kde je vyžadována vysoká citlivost, specifičnost a reprodukovatelnost. Správná příprava vzorku odstraňuje bílkoviny, fosfolipidy a další rušivé složky matrice, čímž se minimalizují matrix efekty a zvyšuje se životnost chromatografické kolony a spolehlivost LC-MS měření.

Cíle a přehled studie

Cílem diskutované metodiky je stanovit robustní protokol pro izolaci a kvantifikaci terapeutických i endogenních peptidů z biologických matic (plazma, krev, moč). Studie ukazuje optimální SPE sorbenty, podmínky vzorkové přípravy, volbu kolony a parametry LC-MS analýzy včetně monitorování fosfolipidů a vyhodnocení recovery a matrix efektů.

Použitá metodika

• Disrupce proteinového vázání: 1:1 ředění plazmy 4 % H3PO4 nebo 5 % NH4OH, v závislosti na vlastnostech peptidů, případně doplněné denaturanty (guanidin HCl, SDS).
• Redukce nespecifické adsorpce: použití nízko-vazebných materiálů, nosných proteinů (BSA, sérum) a organických modifierů.
• SPE extrakce: Oasis µElution 96-well formát s WCX pro zásadité a MAX pro kyselé peptidy, umožňující eluci v objemu 25 µL bez kroku sušení a rekonstituce.
• Čištění tryptických digestátů: ProteinWorks µElution SPE protokol s WCX sorbentem pro odstranění bufferů a zbytkových reagentů po štěpení.
• Chromatografie a detekce: UPLC kolony BEH C18 300Å (primární volba), alternativně HSS T3, CSH C18+ nebo BEH C4; tandemová MS (MRM) se specifickými přechody pro peptidy a monitorováním fragmentu 184,4 m/z pro fosfolipidy.

Použitá instrumentace

• Oasis µElution SPE Plate (96-well) s sorbenty WCX, MAX, HLB
• ProteinWorks µElution SPE Clean-up Kit
• UPLC systémy s kolonymi BEH C18, HSS T3, CORTECS C18+
• Tandemový hmotnostní spektrometr (MRM) pro peptidové analýzy

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace WCX a MAX µElution formátu dosahuje SPE recovery >80 % napříč různými peptidy. Optimalizované mycí kroky (5 % NH4OH, 20 % ACN) účinně odstraňují polarické interferující složky bez ztrát cílových peptidů. Monitoring fosfolipidů ukazuje >95 % redukci rušivých látek, matrix efekty jsou pod 15 % suprese. Pro tryptické digestáty je potvrzena vysoká čistota a opakovatelnost analýz.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizovaný, univerzální SPE protokol určený specificky pro peptidy
• Eliminace kroku sušení minimalizuje ztráty a zrychluje workflow
• Možnost koncentrace až 15× bez sušení a opětovné rekonstituce
• Vysoká propustnost: 96 vzorků lze zpracovat za méně než 30 min
• Snížení matrix efektů a prodloužení životnosti LC-MS přístrojů

Budoucí trendy a možnosti využití

S růstem počtu peptidových a proteinových léčiv se předpokládá širší adopce mix-mode SPE sorbentů, mikrodestičkových formátů s vyšší kapacitou a plně automatizovaných HT-SPE systémů. Rozvoj HRMS technik, stable isotope-label standardů a inteligentních algoritmů pro vyhodnocení matrix efektů přispěje k vyšší citlivosti a přesnosti peptidových analýz.

Závěr

Navržená metodika kombinuje disrupci proteinového vázání, redukci nespecifických vazeb, mix-mode SPE a optimalizovanou LC-MS analýzu, čímž poskytuje robustní, citlivý a vysoce reproducibilní workflow pro bioanalýzu terapeutických i endogenních peptidů.

Reference

• Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Anal. Chem. 2003, 75, 3019-3030.
• Little J, Wempe M, Buchanan C. J. Chromatogr. B, 833 (2006) 219-230.