LC-MS/MS Quantification of Intact Insulin-Like Growth Factor I (IGF-I) in Serum for Clinical Research

Význam tématu

Insulin-like growth factor I (IGF-I) je endogenní protein o hmotnosti 7,6 kDa, který významně zprostředkovává účinky růstového hormonu. Jeho koncentrace v séru se pohybuje v rozmezí 15–750 ng/mL v závislosti na věku a zdravotním stavu. Dosavadní stanovení IGF-I probíhá převážně imunoanalytickou cestou, což může být zatíženo omezenou selektivitou, křížovými reakcemi a nákladnými afinitními postupy. Metody LC-MS/MS nabízejí vyšší analytickou selektivitu, přesnost a možnost multiplexování, avšak přímá analýza intactních proteinů, jako je IGF-I, je náročná z hlediska citlivosti, ionizace a vzájemné vazby na nosičové proteiny.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané studie bylo vyvinout rychlou, selektivní a efektivní metodu pro kvantifikaci intactního IGF-I v séru a plasmě za použití analytického průtoku LC-MS/MS. Klíčové požadavky zahrnovaly eliminaci časově náročné afinitní purifikace či enzymatické štěpení, dosažení nízkého LLOQ ~5 ng/mL, lineárního rozsahu 5–1 000 ng/mL a vynikající reprodukovatelnosti.

Použitá metodika

Vzorky (100 µL séra či plasmy) byly denaturovány 100 µL 0,6 % SDS při 37 °C po dobu 60 min, následně precipitovány 200 µL acetonitrilu s 5 % kyseliny octové a centrifugovány. Supernatant byl naředěn vodným roztokem NH4OH a extrahován pomocí Oasis MAX µElution SPE v 96-well formátu. Adsorpce, mytí zásaditou a slabě organickou fází a dvojité eluční kroky metanol/voda/kyselina octová zajistily >90 % celkovou recovery IGF-I.
Chromatografie probíhala na CORTECS UPLC C18+ kolonu (2,1×50 mm, 1,6 µm) při 60 °C s gradientem 0,1 % formiové kyseliny ve vodě a acetonitrilu. Rozdělování intactního proteinu s podstatně nižšími šířkami <6 s vedlo k 4× vyšší hodnotě S/N oproti konvenční C18.
Detekce byla realizována na Xevo TQ-XS v režimu ESI+ s MRM přechody z 7+ a 8+ multiprotonovaných prekurzorů (m/z 1093,0 a 956,4) na fragmenty s m/z >1100 pro maximální selektivitu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LLOQ 5 ng/mL IGF-I v myší plasmě a lineárního rozsahu 5–1 000 ng/mL (r2>0,99) s průměrnou přesností ~101 % a intra-denní variabilitou (%CV) <7 %. V lidském séru byl stanoven LLOQ 100 ng/mL s obdobnými parametry. Recoverie po celém workflow přesahovaly 90 %, což svědčí o účinném narušení komplexu IGF-I/IGFBP a minimalizaci nespecifické absorpce. Výběr vysokom/z fragmentů nad 1 100 významně potlačil pozadí peptidických nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

• Celistvé stanovení intactního IGF-I bez štěpení a afinitní čistící fáze.
• Rychlá příprava vzorku (<1,5 h) a plná automatizace 96-well formátu.
• Vysoká selektivita a citlivost v klinických koncentracích.
• Možnost multiplexního rozšíření na další proteiny či peptidy v jednom běhu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda otevírá prostor pro rozšířenou panelovou analýzu biomarkerů růstových faktorů a jejich analogů v klinickém výzkumu a farmakokinetice. Dále lze očekávat integraci do plně automatizovaných linek s vyšším průtokem vzorků a rozšíření na kvantifikaci modifikovaných forem či sedeotypových variant IGF-I.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda nabízí robustní, citlivé a vysoce selektivní stanovení intactního IGF-I v biologických matricích. Umožňuje snížení nákladů a času oproti tradičním imunoasayím při zachování vysoké kvality dat pro klinický a farmakologický výzkum.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class System
• Xevo TQ-XS Mass Spectrometer (ESI+)
• Oasis MAX µElution SPE plate
• CORTECS UPLC C18+ kolona (2,1×50 mm, 1,6 µm)
• MassLynx v4.2 a TargetLynx pro zpracování dat

Reference

1. Lopes F, Cowan DA, Thevis M, Thomas A, Parkin MC. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014;28:1426–1432.
2. Bidlingmaier M, Friedrich N, Emeny RT, et al. J Clin Endocrinol Metab. 2014;99(5):1712–1721.