Stanovení celkové antioxidační aktivity v biologickém materiálu pomocí FIA-ECD metody

Význam tématu

Antioxidační aktivita biologických vzorků je klíčovým ukazatelem schopnosti odstraňovat reaktivní kyslíkové druhy a chránit buňky před oxidačním poškozením. Rychlé a spolehlivé stanovení celkové antioxidační kapacity (TAC) umožňuje evaluovat nutriční doplňky, potraviny i endogenní faktory, jako je lidská moč, a poskytuje přínosné informace pro biomedicínský výzkum a diagnostiku.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje vývoj a aplikaci metody průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí (FIA-ECD) pro kvantifikaci celkové antioxidační aktivity lidské moče. Cílem bylo porovnat TAC naměřenou pomocí FIA-ECD s vybranými biomarkery oxidačního poškození nukleových kyselin stanovenými metodou HPLC-MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika FIA-ECD:

• Přístroje: ESA Model 582 Solvent Delivery Module, Model 542 HPLC Autosampler, detektor CoulArray ESA Model 5600A
• Mobilní fáze: 90 % KH2PO4 0,05 M + 10 % acetonitril, pH 4,8
• Průtok: 1 ml/min, isokratický režim
• Injekce: 10 µl, rediluce moče 1:3 (moč:mobilní fáze)
• Detekční potenciály: 200, 400, 600, 800 mV
• Analytický čas: 1,1 min

HPLC-MS/MS pro markery poškození DNA a RNA:

• Přístroj: UltiMate 3000 Binary RSLC + TSQ Quantum Access Max (Thermo Fisher Scientific)
• Kolona: Kinetex F5 100 Å, 1,7 µm, 50×2,1 mm
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě, B: 0,1 % kyseliny mravenčí v methanolu
• Ionizace: ESI+, scénovací mód SRM
• Teploty: kapilára 325 °C, odpařovací jednotka 300 °C
• Tlak kolizního plynu: 1,5 mTorr; sušící plyn 45 arb; čisticí plyn 2 arb; sprejovací napětí 3 300 V

Hlavní výsledky a diskuse

V období prosinec 2017 až listopad 2018 bylo analyzováno 281 vzorků moče jednoho dobrovolníka. Průměrná TAC naměřená FIA-ECD dosáhla 360 ± 128 µC/ml (rozsah 88–872 µC/ml). Koncentrace 8-hydroxyguanosinu a 8-hydroxy-2′-deoxyguanosinu v moči se pohybovaly v rozsazích 1,5–163 ng/ml a 0,1–103 ng/ml. Neukázala se korelace mezi úrovní těchto biomarkerů a celkovou antioxidační kapacitou.
Interindividuální i intraindividuální variability TAC zdůrazňují význam kontinuálního monitoringu a možnost využití moče jako neinvazivního vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda FIA-ECD poskytuje následující výhody:

• Rychlé měření (1,1 min) s minimální přípravou vzorku
• Vysoká citlivost a reprodukovatelnost vyjádřená v µC
• Univerzální hodnocení celkové antioxidační kapacity nedeterminované konkrétními antioxidanty
• Možnost online analýzy nápojů, potravin, doplňků i biologických tekutin

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metody může zahrnovat:

• Integrované systémy pro multiplexní detekci specifických antioxidantů podél celkové TAC
• Aplikace v klinické praxi pro monitoring oxidačního stresu u různých onemocnění
• Automatizace přípravy vzorků a datová integrace s LIMS
• Rozšíření na jiná biologická média (sérum, plazma, sliny)

Závěr

Vyvinutá FIA-ECD metoda je rychlý, citlivý a univerzální nástroj pro stanovení celkové antioxidační aktivity biologických vzorků. Umožňuje nezávislé srovnání TAC mezi různými matricemi a poskytuje hodnotná data pro nutraceutické, potravinářské i klinické aplikace.