Development of a SPE LC-MS/MS Method for the Bioanalytical Quantification of Salmon Calcitonin from Human Serum

Význam tématu

Salmoní kalcitonin (sCT) je syntetický 32-aminokyselinový peptid používaný v terapii Pagetovy choroby, osteoporózy a hyperkalcémie. Jeho farmakokinetika se vyznačuje velmi rychlou absorpcí a eliminací, což vede k nízkým plazmatickým koncentracím v rozsahu pg/mL. Precizní a citlivá kvantifikace sCT je klíčová pro farmokokinetické studie a kontrolu biologické dostupnosti léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní bioanalytickou metodu založenou na kombinaci SPE v µElution formátu, UPLC separaci a tandemové kvadrupólové hmotnostní spektrometrii (LC-MS/MS) pro kvantifikaci sCT z lidské séra. Metoda má dosáhnout LLOQ 25 pg/mL z 100 µL vzorku s jednoduchou, rychlou přípravou a vysokou selektivitou.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Proteinová precipitace: 1:1 serum/acetonitril (100 µL/100 µL), centrifugace 13 000 RCF, 10 min.
• SPE: Oasis WCX 96-well µElution plate, nabití v 2 × 375 µL, promytí 5 % NH4OH a 20 % ACN, eluce 1 % TFA v 75/25 ACN/H2O, finální objem 50 µL.

Instrumentace:

• ACQUITY UPLC I-Class s kolónou CORTECS UPLC C18+, 1.6 µm, 2.1 × 50 mm, 60 °C.
• Xevo TQ-XS Tandem Quadrupole MS v režimu ESI+, MRM přechody 5+ (m/z 687.5→830.3) a 4+ (m/z 859.2→1106.7).
• MassLynx a TargetLynx pro řízení instrumentů a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie na pevném jádru CORTECS C18+ poskytla špičkové parametry: šířku píků <4 s, poměr signál/šum >2000, analýzu do 5 minut. SPE s použitím Oasis WCX dosáhla extrakčních výtěžností >90 % a maticových efektů <15 %. Metoda byla lineární v rozmezí 25–1500 pg/mL (r2>0,99), s intra- i interdenní přesností a přesností v souladu s bioanalytickými směrnicemi (accuracy 85–115 %, CV <15 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Nízký objem vzorku (100 µL séra).
• Rychlá 96-well příprava (<2 h) bez potřeby lyofilizace nebo trávení.
• Vysoká selektivita a citlivost díky MRM přechodům nad m/z 800.
• Možnost multiplexního měření dalších peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit pro kvantifikaci dalších terapeutických peptidů nebo proteinů. Automatizace SPE v mikroformátu, integrace s vysokorychlostními hmotnostními spektrometry a použití hybridních technik (HRMS) mohou dále zvýšit citlivost a flexibilitu bioanalytických laboratoří.

Závěr

Vyvinutá SPE LC-MS/MS metoda spojuje jednoduchou a rychlou přípravu vzorku s vysoce výkonnou UPLC separací a selektivní MRM detekcí. Dosahuje LLOQ 25 pg/mL z malého objemu séra, splňuje přísné požadavky na přesnost a preciznost a nabízí efektivní alternativu ke klasickým ligand-binding assay.

Reference

1. Zeng K., Geerlof-Vidavisky I., Gucinski A., Jiang X., Boyne M. Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry for Peptide Drug Quality Control. AAPS Journal 2015;17(3).
2. Novartis. Miacalcin (Calcitonin-salmon) United States package insert, October 2009.
3. Salmon calcitonin, structure from DrugBank. Retrieved May 30, 2018.
4. Li Y., Hackman M., Wang C. Quantitation of Polypeptides (Glucagon and Salmon Calcitonin) in Plasma Samples by ‘High Resolution’ on a Triple Quadrupole Mass Spectrometer. Bioanalysis 2012;4(6):685–691.