Rapid AAV Concentration Determination Using Size-Exclusion Chromatography with Fluorescence and UV Dual Detection

Význam tématu

Stanovení koncentrace AAV kapsid je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality genové terapie. Rychlá a přesná analýza usnadňuje optimalizaci výrobních procesů a zajištění konzistentního dávkování.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje dvouminutovou metodu SEC s dvojitou detekcí UV a fluorescencí pro kvantifikaci AAV8 kapsid v rozsahu od 2,6e11 do 2,0e12 Cp/mL při minimální přípravě vzorku (1 µL). Součástí je odhad poměru prázdných a naplněných kapsid (E/F) na základě poměru A260/A280.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a online výměnu pufru slouží guard column ACQUITY UPLC Protein BEH SEC (30 mm, 125 Å, 1,7 µm). Tok mobilní fáze obsahuje 10 mM NaH2PO4/Na2HPO4 a 200 mM KCl (pH 6,6) při 0,20 mL/min a 25 °C. Objem injekce 1 µL.
Detekce:

• UV/VIS PDA detektor (A280 a A260)
• Fluorescenční detektor (ex 280 nm, em 350 nm)

Data zpracováno v Empower 3.

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární vztah koncentrace a signálů byl prokázán pro UV i FLR. Vypočtené faktory odpovědi pro prázdné vs. naplněné kapsidy (RF/E) jsou A260=6,81, A280=2,98 a FLR=0,875. Fluorescenční detekce poskytuje až 10× vyšší poměr signál/šum a nižší citlivost na variace poměru E/F než UV při 280 nm, což vede k lepší opakovatelnosti (průměrná odchylka 0,67 %) oproti UV280 (1,27 %). Poměr A260/A280 umožňuje odhad E/F poměru inline a korekci signálu bez dodatečných analýz.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza (2 min) s vysokou propustností
• Minimální objem vzorku (1 µL)
• Vyšší selektivita a citlivost díky fluorescenční detekci
• Inline odhad poměru prázdných a naplněných kapsid

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s aniontovou výměnnou chromatografií pro přesnější stanovení E/F
• Adaptace na různé AAV serotypy s odlišným složením DNA
• Nasazení delších SEC kolón pro vzorky s interferencemi
• Využití větších průměrů kolón a větších částic pro průmyslové systémy
• Automatizace a rozšíření na multi-detektorové platformy

Závěr

Popsaná SEC-UV-FLR metoda umožňuje rychlé, citlivé a přesné stanovení koncentrace AAV kapsid s možností automatizovaného odhadu E/F poměru. Fluorescenční detekce zvyšuje selektivitu a zlepšuje opakovatelnost výsledků.

Reference

1. Werling N. J. et al. Human Gene Therapy Methods 2015, 26(3):82–92
2. Andreasson U. et al. Frontiers in Neurology 2015;6:179
3. Sommer J. M. et al. Molecular Therapy 2003;7(1):122–128
4. Runnels H. CMC Strategy Forum 2017
5. Wang C. et al. Molecular Therapy Methods & Clinical Development 2019;15:257–263
6. Noble J. E. Methods in Enzymology 2014, 536:17–26