LC-UV-MS-based Synthetic Peptide Identification and Impurity Profiling Using the ACQUITY QDa Detector with ProMass Software

Význam tématu

Svět syntetických peptidů roste díky jejich specifické biologické aktivitě a nízké toxicitě. Výroba pomocí solid-phase syntézy však často generuje procesní a produktové nečistoty, jako je nedokončená deprotekce, oxidace či deamidace. Regulace ICH vyžaduje identifikaci a kvantifikaci těchto nečistot podle hladiny expozice a toxicity. Kombinovaná metoda LC-UV s hmotnostní spektrometrií (MS) významně zvyšuje přesnost, citlivost a rychlost profilování nečistot.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo demonstrovat vysoce automatizovaný a nákladově efektivní LC-UV-MS workflow pro potvrzení hmotnosti a monitorování nečistot syntetických peptidů. Jako modelová sloučenina byl vybrán peptid eledoisin, analyzovaný in-line pomocí ACQUITY QDa Detectoru, MassLynxu a softwaru ProMass.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: Eledoisin v koncentraci 2 mg/ml, optimální vnesená hmotnost 2 µg při objemu injekce 5 µl.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC H-Class Bio se CSH C18 kolónou (2.1 × 100 mm, 1.7 µm), gradient 18 % → 28 % B za 20 minut, teplota kolony 60 °C, detekce UV při 215 nm.
• Hmotnostní spektrometrie: ACQUITY QDa Detector, rozsah 350–1250 m/z, ESI v pozitivním módu, cone voltage 10 V, teplota sondy 500 °C, sběr 2 bodů/s.
• Software: MassLynx 4.1 pro akvizici dat, ProMass (ProMassBridge a Znova parametry) pro automatizovanou dekonvoluci a identifikaci nečistot.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný gradient v délce 20 minut umožnil rozlišení 11 nečistot k hlavnímu píku. Impurity s relativním zastoupením nad 0,2 % a S/N ≥ 10 bylo osm, všechny byly potvrzeny v MS spektru. Studie dávkování demonstrovala, že 2 µg vzorku poskytuje nejlepší kompromis mezi chromatografickým rozlišením a citlivostí (%RSD < 5 %). ProMass automaticky přiřadil ke každé nečistotě rozdíl hmotnosti a navrhl možnou identitu (oxidace Met, ztráta Ser či Leu, C-terminální modifikace). Výsledky vykazovaly vynikající reprodukovatelnost ve třech replikách.

Přínosy a praktické využití metody

• Online profilování nečistot bez potřeby frakcionace a obšírné přípravy.
• Snížení provozních nákladů díky kompaktnímu MS detektoru QDa.
• Automatizované zpracování dat ve stávajících QA/QC postupech přispívá k vyšší propustnosti laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda je perspektivní pro rozšíření na další peptidy a oligonukleotidy, včetně modifikovaných derivátů. Další vývoj směřuje k integraci s vysokým rozlišením MS pro detekci nízko zastoupených nečistot, zdokonalení databází modifikací a plné automatizaci v GMP prostředí.

Závěr

Popsaný LC-UV-MS workflow s ACQUITY QDa Detector a ProMass ukázal spolehlivé potvrzení hmotnosti a komplexní profilování nečistot syntetických peptidů. Metoda je rychlá, reprodukovatelná a ekonomická, což ji předurčuje pro rutinní použití ve vývoji i kontrole kvality peptidových léčiv.

Reference

• Vlieghe M., Lisowski V., Martinez J., Khrestchartisky M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug Discovery Today. 2010;15:40–56.
• Sanz-Nebot V., Toro I., Barbosa J. Fractionation and characterization of a crude peptide mixture for the synthesis of eledoisin by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr A. 1999;846:25–38.
• Zeng K., Geerlof-Vidavisky I., Gucinski A., Jiang X., Boyne M.T. Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry for peptide drug quality control. AAPS J. 2015;17:643–651.
• Guidance for industry Q3B(R2) Impurities in new drug products. ICH. 2006;Revision 2.
• Birdsall R.E., McCarthy S.M. Increasing specificity and sensitivity in routine peptide analyses using mass detection with the ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note. 2015.
• Birdsall R.E., Yu Y.Q. High-throughput screening of oligonucleotides for identity and purity assessment using the ACQUITY QDa Detector and ProMass for MassLynx. Waters Application Note. 2016.