Synthetic Peptide Characterization and Impurity Profiling Using a Compliance-Ready LC-HRMS Workflow

Význam tématu

Peptidová léčiva představují dynamicky se rozvíjející třídu terapeutických látek s vysokou biologickou aktivitou a nízkou toxicitou. Regulace kvality syntetických peptidů, zejména profilování nežádoucích vedlejších produktů, je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti. Přísné požadavky mezinárodních směrnic (ICH, FDA) vyžadují spolehlivé, citlivé metody pro detekci a kvantifikaci stopových nečistot.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo demonstrovat plně kompatibilní LC-HRMS workflow pro charakterizaci syntetických peptidů a profilování jejich nečistot. Jako modelové peptidy byly použity Eledoisin a salmoní kalcitonin. Představený přístup kombinuje vysoce výkonné chromatografické oddělení, vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrii a informační platformu UNIFI s automatizovanými postupy pro akvizici, zpracování a reportování dat.

Použitá metodika a instrumentace

Kapalinová chromatografie:

• Systém ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Detektor ACQUITY UPLC Tunable Ultraviolet při 214 nm
• Kolona ACQUITY UPLC Peptide CSH C18, 1,7 µm, 2,1×100 mm, 65 °C
• Gradient 0,1 % HCOOH v H₂O vs. 0,1 % HCOOH v acetonitrilu (Eledoisin 16–24 % B/30 min, kalcitonin 14–34 % B/20 min)

Hmotnostní spektrometrie:

• Vion IMS QTof Mass Spectrometer
• Capillary 2,8 kV, Cone 50 °C, Source 50 °C, Desolvation 300 °C
• MS acquisition v režimu MS^E pro fragmentaci a potvrzení aminokyselinové sekvence

Informatika:

• UNIFI Scientific Information System 1.9.2 s workflow Peptide Mapping a Accurate Mass Screening
• Vlastní knihovna API a nečistot pro vysokopropustnou analýzu
• Automatizované výpočty % čistoty, % relativní abundance a limitní kontroly

Hlavní výsledky a diskuse

HRMS umožnilo odhalení nízkoúrovňových nečistot, které zůstávají skryté v UV chromatogramu. Pomocí UNIFI bylo možné:

• Importovat primární sekvenci a definovat modifikace vedoucí k nečistotám (pyroglutamace, ochranné skupiny, inserce/delece aminokyselin, oxidace)
• Vytvořit mirror plot pro vizuální porovnání vzorku a referenčního chromatogramu
• Potvrdit API Eledoisin prostřednictvím MS/MS fragmentů s N-terminální pyroglutamací a C-terminální amidací
• Sestavit vlastní knihovnu nečistot s neutralní hmotností, vztahem k retenčnímu času a fragmenty
• Provést rutinní screening s automatickými limitními kontrolami (0,5 % jako chybový limit, varovný limit) a reportovat %RSD (<3 % i u stopových nečistot)

Přínosy a praktické využití metody

Provozní výhody:

• Plná kompatibilita s regulačními požadavky ICH a FDA
• Automatizované zpracování a reportování zvyšující produktivitu laboratoře
• Možnost rychlého spuštění vysokopropustného screeningového módu pro široké spektrum syntetických peptidů
• Přehledné limitní kontroly a statistiky kvality analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření knihovny o další modifikace a nestandardní aminokyseliny
• Integrace s LIMS a systémy pro správu výrobních dat
• Využití umělé inteligence pro pokročilou interpretaci MS/MS dat a predikci nečistot
• Automatizovaná validace a dokumentace v plně digitálním laboratorním prostředí

Závěr

Představené LC-HRMS workflow s UNIFI poskytuje robustní, citlivé a plně provozuschopné řešení pro charakterizaci syntetických peptidů a jejich nečistot. Díky automatizaci, vlastní knihovně a limitním kontrolám usnadňuje dodržování regulačních požadavků a zrychluje kvalifikační proces v biotechnologických i farmaceutických laboratořích.

Reference

• FDA Guidance for Industry: Biosimilars Q&A Regarding BPCI Act, 2016.
• Kaspar AA, Reichert JM. Future directions for peptide therapeutics development. Drug Discov Today. 2013;18(17):807–817.
• Mason JM. Design and development of peptides and peptidomimetics as antagonists for therapeutic intervention. Future Med Chem. 2010;2(12):1813–1822.
• Pernot M et al. Stability of peptides and therapeutic success in cancer. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2011;7(7):793–802.
• Uhlig T et al. The emergence of peptides in the pharmaceutical business. EuPA Open Proteomics. 2014;4:58–69.
• Verbeken M et al. Purity profiling of peptide drugs. J Bioanal Biomed. 2012;S6:003.
• ICH Q3A Impurities in New Drug Substances. 2002.
• ICH Q6A Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria. 1999.
• ICH Q3B Impurities in New Drug Products. 2003.
• Eggen I et al. Control Strategies for Synthetic Therapeutic Peptide APIs. 2014.
• Zeng K et al. LC-HRMS for peptide drug quality control. AAPS J. 2015;17(3):643–651.
• Zhang X et al. LC-UV-MS-based Synthetic Peptide Identification and Impurity Profiling. 2017.