Improving SEC-MALS Data Quality with Ethylene Bridged Hybrid HPLC Size-Exclusion Columns

Význam tématu

Size-exclusion chromatografie s víceúhlým rozptylem světla (SEC-MALS) je klíčová pro charakterizaci agregací a molekulových hmotností biologických proteinů v biotechnologických a farmaceutických přípravcích.
Vysoká kvalita dat z SEC-MALS snižuje riziko imunogenních odpovědí a zlepšuje spolehlivost kontroly kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo porovnat výkonnost etylenem propojené organosilikátové kolony XBridge Protein BEH SEC (200 Å, 3,5 µm) s běžnou diol-bonded křemíkovou SEC kolonou (250 Å, 5 µm) v SEC-MALS experimentech.
Hodnoceny byly doba kondicionace, úroveň baselinového šumu, chromatografická účinnost, rozlišení proteinových populací a přesnost určení molekulových hmotností.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda:

• Analýza proteinových standardů (thyroglobulin, IgG, BSA, myoglobin, uracil) a vzorku adalimumabu (Humira) 1 mg/mL.
• Kondicionace kolon jednou hodinou průtoku mobilní fází (20 mM fosfát, 5,4 mM KCl, 274 mM NaCl, pH 7,4) při 1,0 mL/min.
• Injekce 10 µL, teplota kolony 25 °C, vzorku 10 °C, detekce UV při 280 nm a MALS na úhlu 43,6°.

Instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class Bio systém.
• XBridge Protein BEH SEC Column 200 Å, 3,5 µm; diol-bonded silica SEC Column 250 Å, 5 µm.
• ACQUITY UPLC TUV detektor, Wyatt miniDAWN TREOS MALS detektor.
• Software Empower 3 a Wyatt Astra 7.

Hlavní výsledky a diskuse

BEH kolona vykázala rychlejší kondicionaci a snížila baselinový šum MALS signálu z ~0,00040 V na ~0,00011 V.
Chromatografická účinnost vzrostla o ~41 % (45 000 vs. 32 000 platů USP).
Rozlišení mezi monomerem IgG a BSA se zlepšilo z Rs 1,89 na Rs 2,62, S/N u myoglobinu (17 kDa) vzrostlo z 9 na 25.
Analýza adalimumabu ukázala lepší oddělení fragmentu LMW1 (P/V 2,04 vs. 1,11), detekci nízkopodílových HMW agregátů (S/N ~3) a přesné určení molekulových hmotností (monomer ~140 kDa, dimer ~270 kDa).

Přínosy a praktické využití metody

Vylepšené BEH kolony umožňují spolehlivější detekci nízkomolekulárních proteinů a nízkoabundentních agregátů.
Zvýšené rozlišení podporuje robustní QA/QC postupy, hodnocení biosimilarity a analýzu léčivých proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

BEH SEC kolony lze aplikovat ve vysokopropustných systémech pro pokročilé charakterizace biologik.
Očekává se další rozšíření do analýzy konjugovaných biomolekul, peptidů a komplexních terapeutik s nízkou molekulovou hmotností.

Závěr

Organosilikátová XBridge Protein BEH SEC kolona prokázala v SEC-MALS experimentech významné zlepšení kondicionace, snížení baselinového šumu, zvýšení chromatografické účinnosti a přesnosti určení molekulových hmotností oproti klasické silikonové koloně.

Reference

1. Ratanji KD; Derrick JP; Dearman RJ; Kimber I. Immunogenicity of therapeutic proteins: influence of aggregation. Journal of Immunotoxicology. 2014;11:99–109.
2. Arakawa T; Philo JS; Ejima D; Tsumoto K; Arisaka F. Aggregation analysis of therapeutic proteins, part 2. Bioprocess International. 2007;5:36–47.
3. Shapiro M. An FDA perspective on the implementation of state-of-the-art analytical methods for therapeutic proteins. ECI Symposium Series. 2017.
4. Beirne J; Truchan H; Rao L. Development and qualification of a size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering method for molecular weight determination of unfractionated heparin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011;399:717–725.
5. Liu J; Eris T; Li C; Cao S; Kuhns S. Assessing analytical similarity of proposed Amgen biosimilar ABP 501 to adalimumab. BioDrugs. 2016;30:321–338.