Pre-clinical estimation of cetuximab using nano-surface and molecular orientation limited (nSMOL) proteolysis and LC-MS/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují revoluční přístup v onkologické terapii díky své schopnosti specificky cílit nádorové antigeny a zlepšovat výsledky léčby. Přesná kvantifikace těchto biologik v biologických matricích je zásadní pro farmakokinetické studie a vývoj nových biofarmak.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na preklinické stanovení koncentrace cetuximabu v plazmě potkanů pomocí selektivní proteolýzy nSMOL a následné LC-MS/MS analýzy. Cílem bylo vyvinout citlivou a specifickou metodu s minimem matrikové interference.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation proběhla podle nSMOL protokolu, který využívá rozdíl velikosti nanopartikulí a pórů pryskyřice pro selektivní štěpení Fab části protilátky. Analýza peptidů se uskutečnila na UHPLC Nexera X2 spojeném s triple kvadrupólovým spektrometrem LCMS-8060. Hlavní kroky a parametry:

• Imobilizace protilátky na pryskyřičné částice a selektivní proteolýza Fab oblasti trypsinem
• Odstranění nepotřebných peptidů a sběr signaturního peptidu GPSVFPLAPSSK
• UHPLC separace na sloupci Shim-pack GISS C18 s gradientem formiová kyselina/vodní fáze a acetonitril
• Detekce pomocí MRM tranzic 594>699 pro cetuximab a 512>292 pro interní standard P14R

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala lineární rozmezí od 0,29 do 150 µg/mL s koeficientem R2 = 0,9984. Přesnost stanovení standardů a QC vzorků byla v rozsahu 84–120 %, s opakovatelností lepší než 15 %. Díky minimalizaci backgroundu a selektivitě nSMOL protokolu se výrazně zlepšila stabilita dat a reproducibilita analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená technika umožňuje rychlý vývoj kvantitativních metod pro monoklonální protilátky, s vysokou specifičností a citlivostí i v komplexních matricích. Tento přístup je ideální pro preklinické farmakokinetické studie a může urychlit vývoj biosimilárních i originálních léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda nSMOL v kombinaci s pokročilou LC-MS/MS detekcí má potenciál pro automatizaci a vysokopropustné analýzy dalších monoklonálních protilátek. V budoucnu lze očekávat širší nasazení v klinických PK studiích, in vitro–in vivo translaci a vývoji personalizované medicíny.

Závěr

Vyvinutá metoda pro stanovení cetuximabu v potkaní plazmě je citlivá, specifická a robustní. nSMOL proteolýza ve spojení s UHPLC-MS/MS nabízí efektivní řešení pro preklinické kvantifikační studie monoklonálních protilátek.

Reference

• Iwamoto N, et al., Analytical Methods, Volume 7, Issue 21 (2015), 9177–9183.
• Iwamoto N, et al., Analyst, Volume 139, Issue 3 (2014), 576–580.
• Iwamoto N, et al., Drug Metabolism and Pharmacokinetics, Volume 31, Issue 1 (2016), 46–50.
• Iwamoto N, et al., Bioanalysis, Volume 8, Issue 10 (2016), 1009–1020.