LCMS Bioanalysis of Antibody Drugs Using Fab-selective Proteolysis “nSMOL Method” — Selection of Signature Peptide —

Význam tématu

Monoklonální protilátky se v moderní medicíně široce využívají pro léčbu řady onemocnění. Přesné stanovení jejich koncentrace v biologickém vzorku je zásadní pro farmakokinetické a toxikologické studie. Konvenční ELISA metody často trpí zkříženou reaktivitou a interferencemi, zatímco LC-MS/MS založené na strukturálních informacích poskytuje vyšší specifitu a robustnost.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje nový přístup Shimadzu nSMOL (nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis) k selektivní proteolýze Fab regionu monoklonálních protilátek a protokol výběru signaturních peptidů vhodných pro kvantitativní farmakokinetické analýzy pomocí MRM na triple kvadrupólovém LCMS.

Použitá metodika

Metoda nSMOL kombinuje následující kroky:

• Imunoprecipitace cílových protilátek pomocí speciálního pryskyřičného nosiče.
• Selektivní trávení Fab fragmentu immobilizovaným trypsinem na nanobeads (FG beads Trypsin DART).
• Odběr produkovaných variabilních regionem specifických peptidů bez potřeby denaturace, redukce či alkylačního kroku.
• MRM kvantifikace vybraných signaturních peptidů.

Použitá instrumentace

• LCMS-8050/8060 triple kvadrupólový spektrometr (TQ-LCMS) pro MRM analýzu.
• Vysokorozlišovací TOF-MS pro potvrzení struktury peptidů.
• Trypsin-immobilizované nanopartikule FG beads Trypsin DART pro selektivní proteolýzu.
• Imunoglobulin sběrné pryskyřice pro izolaci mAb.
• Softwarové nástroje Skyline a LabSolutions pro plánování a optimalizaci MRM přechodů.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza sekvenčního zarovnání Fv oblastí několika chimerických a humanizovaných protilátek odhalila variabilitu CDR1–CDR3. Signaturní peptidy byly vybrány tak, aby obsahovaly unikátní aminokyselinné motivy, minimalizovaly potencionální heterogenitu N-konců a nezasahovaly do matricových interferencí. Kombinace vysokorozlišovacího MS a sekvenčního plánování MRM přechodů umožnila robustní a opakovatelnou kvantifikaci v komplexních biologických maticích.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší selektivita a přesnost oproti ELISA.
• Redukce interferencí a potlačení pozadí díky selektivní proteolýze Fab.
• Jednodušší workflow bez potřeby složitých úprav vzorku po trávení.
• Univerzální přístup aplikovatelný na různé typy mAb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na multiplexní analýzy více protilátek v jedné injekci, automatizaci přípravy vzorků a integraci strojového učení pro predikci signaturních peptidů. Dále jsou perspektivní kombinace s novými ionizačními technikami a rozšíření na jiné biologické makromolekuly.

Závěr

nSMOL metoda představuje inovativní přístup pro selektivní a robustní proteolýzu Fab regionu monoklonálních protilátek. Ve spojení s MRM na triple kvadrupólovém LCMS umožňuje spolehlivou kvantifikaci signaturních peptidů a poskytuje cenné farmakokinetické informace.

Reference

• Iwamoto N et al. Analyst, DOI:10.1039/c3an02104a
• Iwamoto N et al. Bioanalysis, DOI:10.4155/bio-2016-0018
• Iwamoto N et al. Biol. Pharm. Bull., DOI:10.1248/bpb.b16-00230
• Iwamoto N et al. Clin. Pharm. Biopharm., DOI:10.4172/2167-065X.1000164