Development of bioanalytical method for determination of intact human insulin from plasma using LC/MS/MS

Význam tématu

Quantifikace intactního lidského inzulinu v séru či plazmě je klíčová pro sledování farmakokinetiky a účinnosti bioterapeutik. Tradiční imunologické metody (ELISA, RIA) mohou trpět křížovou reaktivitou, dlouhým časem vývoje a vlivem matrix. LC/MS/MS přináší vyšší selektivitu díky MRM, širší dynamický rozsah a rychlejší vývoj metody.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní bioanalytickou metodu pro stanovení intactního lidského inzulinu v lidské plazmě s nízkou mezí kvantifikace (LOQ). Pracovní postup zahrnoval:

• Přípravu vzorků pomocí SPE (HLB kartičky) z plazmy bez endogenního inzulinu (charcoal stripped).
• Separaci a detekci intactního inzulinu metodou UHPLC–MS/MS (Shimadzu Nexera – LCMS-8060).
• Validaci metody v rozsahu 15–500 pM/L s interním standardem bovinního inzulinu.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Charcoal stripped lidská plazma obohacená o intactní lidský inzulin (15–500 pM/L) a bovinní inzulin jako interní standard.
• Extrahováno na HLB SPE kartičkách za účelem odstranění matricových interferencí.

Chromatografie a detekce:

• UHPLC kolona C18, gradientní eluce s mobilní fází A (0,1 % HCOOH ve vodě) a B (0,1 % HCOOH v acetonitrilu), teplota kolony 40 °C.
• MS/MS: ESI pozitivní režim, MRM přechod inzulinu m/z 1162,30>1158,90, bovinního IS m/z 956,40>136,30.
• Využití vyhřívané ESI sondy pro lepší desolvaci kapek (horký plyn a nebulizace).
• Parametry plynů: nebulizační plyn 3 L/min, sušící plyn 10 L/min, horký plyn 18 L/min; teploty DL 200 °C, heat block 400 °C, rozhraní 350 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Lineární kalibraci v rozmezí 15–500 pM/L s korelačním koeficientem r2=0,9968.
• LOQ 15 pM/L splňující kritéria přesnosti (80–120 %), preciznosti (%RSD <20 %) a S/N >10.
• Opakovatelnost a přesnost QC vzorků (LQC, MQC, HQC) v požadovaných mezích.
• Absence interferencí v blank cartridge plazmě.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda nabízí:

• Vysokou citlivost a selektivitu pro intactní peptidové hormony.
• Rychlou přípravu a vysokou propustnost analýzy.
• Možnost multiplexního stanovení dalších bioterapeutik.
• Snížení nákladů a zkrácení doby vývoje oproti imunoanalýzám.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o:

• Multiplexní stanovení dalších peptidů a proteinů.
• Imunokapturační enrichování pro ultra-snížení matričních interferencí.
• 2D-LC nebo microflow techniky pro zlepšení rozlišení a citlivosti.
• Nasazení ve vysoce automatizovaných platformách pro klinické a průmyslové aplikace.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda umožňuje spolehlivé stanovení intactního lidského inzulinu v plazmě s LOQ 15 pM/L, širokým dynamickým rozsahem a vysokou propustností. Ultrahigh citlivý detektor LCMS-8060 a vyhřívaná ESI sonda významně přispívají k celkové výkonnosti metody.

Reference

• Li Y.-X., et al. Development of bioanalytical method for intact human insulin. J Anal Bioanal Tech. 2013; S5:004.
• Taylor S.W., et al. Quantitation of insulin by LC–MS/MS. Clin Chim Acta. 2016;455:202–208.