Highly sensitive simultaneous quantitative analysis of estrone and equilin from plasma using LC/MS/MS

Význam tématu

Citlivá a současná kvantifikace estronu a equilinu v plazmě je klíčová pro farmakokinetické studie a hodnocení hormonální substituční terapie. Estron je běžným ženským estrogenním steroidem, zatímco equilin pochází z koní a není fyziologicky přítomný u lidí. Přítomnost equilinu ve formě Premarinu zvyšuje potřebu spolehlivých analytických metod s nízkými limity detekce pro bezpečnostní a regulační účely.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a vysoce citlivou LC/MS/MS metodu schopnou simultánní kvantifikace estronu a equilinu v nízkých koncentracích (pg/mL) v lidské plazmě. Metoda má sloužit pro bioanalytické aplikace, vyžadující široký rozsah kalibrace, přesnost a reprodukovatelnost při nízkých hladinách analyzovaných sloučenin.

Použitá metodika a instrumentace

Pro eliminaci endogenního estronu byla plazma ošetřena aktivním uhlím. Kalibrační standardy a kontrolní vzorky (LLQC, LQC, MQC, HQC) byly připraveny do stripované plazmy v rozsahu 1,525 – 541,815 pg/mL pro estron a 1,117 – 358,660 pg/mL pro equilin. Extrakce proběhla prostřednictvím SPE (kondice, nanesení vzorku, promytí, eluace) a sušení v N2 odpařovači.

Instrumentace:

• UHPLC Nexera X2 se C18 kolonkou (150×4,6 mm, 3 µm), isokratická eluce methanol–pufr, průtok 0,7 mL/min, teplota 40 °C.
• LCMS-8060 třetí kvadrupól se zahřívanou ESI hlavou, rychlost skenování 30 000 u/s, přepínání polarity 5 ms.
• MRM přechody: estron 269 → 145, estron-D4 273 → 147, equilin 267 → 265+143, equilin-D4 271 → 144.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LLOQ 1,525 pg/mL pro estron a 1,117 pg/mL pro equilin. Linearity byla prokázána s R² 0,9992 (estron) a 0,9985 (equilin). Princip zahřívané ESI sondy výrazně snížil šum a zlepšil ionizační efektivitu. Preciznost a přesnost kalibračních standardů i QC vzorků splňovaly přísné bioanalytické limity (±15 % při QC, ±20 % pro LLQC).

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda umožňuje spolehlivé sledování nízkých koncentrací estronu a equilinu ve farmakokinetických studiích, monitorování substituční terapie a studium metabolických drah. Díky rychlému průtoku a jednoduché přípravě vzorků lze metodu implementovat v rutinní QC a výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem může být rozšíření panelu sledovaných estrogenů, integrace automatizovaných přípravných stanic a validace v lidských klinických studiích. Kombinace s HRMS metodami by mohla umožnit identifikaci metabolitů a neznámých struktur.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda na přístroji Shimadzu LCMS-8060 dosahuje vysoké citlivosti, přesnosti a reprodukovatelnosti pro simultánní kvantifikaci estronu a equilinu v plazmě. Zahřívaná ESI sonoda a optimalizace SPE extrakce představují efektivní řešení pro bioanalytické aplikace.

Reference

1. Yasui T, Uemura H, Tezuka M, Yamada M, Irahara M, Miura M, et al. Biological effects of hormone replacement therapy in relation to serum estradiol levels. Horm Res. 2001;56:38–44.
2. Giese RW. Measurement of estrogens: analytical challenges and recent advances. J Chromatogr A. 2003;1000:401–412.