Development of 2D-LC/MS/MS Bioanalytical Method for Quantitative Determination of Insulin Glargine in Human Plasma

Význam tématu

Insulin glargine je klíčový analog lidského inzulinu používaný v léčbě diabetu. Přesná a citlivá kvantifikace jeho hladin v lidské plazmě je nezbytná pro farmakokinetické studie, sledování účinnosti léčby a zajištění kvality biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout vysoce citlivou bioanalytickou metodu 2D-LC/MS/MS na přístroji Shimadzu LCMS-8060 coupled s Nexera UHPLC pro kvantitativní stanovení insulin glargine v lidské plazmě bez nutnosti SPE čistění.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly připraveny srážením proteinů přidáním směsi acetonitril-metanol (3:1), následnou filtrací, vysušením a rekonstitucí ve vodě-metanolu (80/20) s 0,1 % kyseliny octové.
Pro chromatografii 2D se využily dvě kolony Kinetex C18 (1. dimenze 2.6 µm, 2. dimenze 1.3 µm) s přepínáním pomocí 6-cestného ventilu. Parametry 1. dimenze: gradient 15–90 % organické fáze, průtok 0,3 ml/min. 2. dimenze: gradient 15–90 %, průtok 0,35 ml/min, frakcionace od 1,50 do 1,73 min.
MS/MS detekce probíhala v ESI pozitivním módu, režim MRM. Ionizace vedla k tvorbě mnohonásobně nabitých iontů (+6 a +7); použity přechody 867.00>984.00 (quantifier) a 1011.50>1179.00 (qualifier).

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivka v rozsahu 0,05–10 ng/ml byla lineární (R2>0,9996) s přesností 98–105 %. LOQ bylo stanoveno na 0,018 ng/ml (odpovídá ~70 pg/ml v plazmě před úpravou). Obnova analyzované látky se pohybovala mezi 63–87 %, opakovatelnost (RSD) mezi 2,3–11,1 %. 2D-LC/MS/MS výrazně redukuje matrixové interferenční látky a eliminuje potřebu SPE, což prodlužuje intervaly údržby MS.

Přínosy a praktické využití metody

• Simplifikace přípravy vzorků bez použití SPE.
• Výrazně vyšší citlivost a specifita díky dvojdimenzionální chromatografii a MRM.
• Snížení kontaminace MS systému při velkém počtu vzorků.
• Aplikace v preklinických a klinických bioanalytických studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků a zvýšení propustnosti analýz.
• Současné stanovení více inzulinových analogů a jejich metabolitů.
• Implementace mikrofluidních a nízkoprůtokových systémů pro úsporu vzorku.
• Využití v terapeutickém monitoringu a personalizované medicíně.

Závěr

Vyvinutá 2D-LC/MS/MS metoda na systému Shimadzu LCMS-8060 nabízí spolehlivou, citlivou a efektivní kvantifikaci insulin glargine v lidské plazmě bez nutnosti SPE, s LOQ odpovídajícím 70 pg/ml, vynikající linearitou, přesností a specifitou.

Reference

1. Blackburn M et al. EBF 2014, Barcelona.
2. Chambers EE, Fountain KJ, Smith N et al. Anal. Chem. 2014;86:694–702.
3. Li YX, Ke Y, Li J et al. J Anal Bioanal Tech. 2013;S5.