Profil proanthokyanidinů v pivu a jeho surovinách

Přítomnost proanthokyanidinů, látek patřících do široké skupiny polyfenolů, je v pivu obecně spíše nežádoucí a to vzhledem k jejich tendenci tvořit komplexy s proteiny, a tím zhoršovat jeho koloidní stabilitu. Na druhé straně, jsou tyto látky prospěšné díky schopnosti vázat volné radikály a tím zlepšovat senzorickou stabilitu piva. Znalost profilu jednotlivých proanthokyanidinů v pivu a surovinách a jejich individuálního chování během celého technologického procesu by mohla napomoci při řešení úkolů spojených se zlepšováním senzorické i koloidní stability piva. Proto byla vypracována nová metoda pro stanovení proanthokyanidinů pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí s vysokým rozlišením. Metoda byla využita pro sledování změn profilu vybraných proanthokyanidinů během pivovarského procesu a následně také pro ověření specificity profilu proanthokyanidinů pro danou odrůdu českého chmele.

1 ÚVOD

Polyfenoly, sekundární metabolity produkované zejména rostlinami, jsou velkou a různorodou skupinou sloučenin, která obsahuje přes 8000 dosud popsaných sloučenin. (Haslam et al., 1994). Proanthokyanidiny, známé také jako kondenzované taniny neboli třísloviny, jsou v přírodě po ligninu druhou nejrozšířenější skupinou polyfenolů (Lazarus et al., 1999). Molekuly flavan-3-olů: páry isomerů katechinu a epikatechinu, gallokatechinu a epigallokatechinu, afzelechinu a epiafzelechinu (viz obr. 1) tvoří základní stavební jednotku kondenzovaných proanthokyanidinů. Tyto flavan-3-ol jednotky mají typickou C6-C3-C6 flavanoidní strukturu, která je tvořena třemi kruhy, dvěma aromatickými kruhy (kruhy A a C) a heterocyklickým kruhem B (Predy et al., 2009). Kondenzací těchto jednoduchých katechinů vznikají proanthokyanidiny jako dimerní, oligomerní nebo až polymerní sloučeniny. Různorodost různých struktur proanthokyanidinů je dána jak vlastní variabilitou monomerních jednotek, tj. počtem hydroxylových skupin na obou aromatických kruzích A a C, tak i stereochemií na asymetrickém uhlíku C3 na kruhu B. K variabilitě také přispívá vlastní typ interflavonoidní vazby, kde ke vlastní kondenzaci monomerních jednotek katechinů může dojít buď mezi uhlíkem C4 vyšší flavonoidní jednotky a uhlíkem C8 (vazba 4→8) nebo C6 (vazba 4→6) nižší flavonoidní jednotky (typ B), případně typ A, kde je vazba tvořena přes éterový můstek mezi uhlíky C2 a C7 (2→O→7) (Lazarus et al., 1999; Santos-Bueiga et al., 2000; Predy et al., 2009). Také další variabilita vzniká při samotné kondenzaci monomerních jednotek a vychází ze stereochemie těchto jednotek, přičemž 2,3-cis enantiomery tvoří (4β)-interflavonoidní vazbu, zatímco 2,3-trans enantiomery (4α)-interflavonoidní vazbu. Struktury dimerů typu A a B jsou zobrazeny na obr. 2.

Obr. 1 Monomerní jednotky proanthokyanidinů (Predy et al., 2009)

Obr. 2 Struktura dimerů proanthokyanidinů (dimer B-typu s vazbou C4→C8 nebo s vazbou C4→C6, dimer A–typu s vazbou C4→C6 a C2-O-C7) (Predy et al., 2009)

Proanthokyanidiny, tvořené výhradně z jednotek katechinu a/nebo epikatechinu, jsou označovány jako prokyanidiny, a dále se dělí na prokyanidiny A a B podle typu interflavonoidní vazby (Predy et al., 2009). Skupina prokyanidinů B se nadále dělí na prokyanidiny s interflavonoidní vazbou (4→8), což jsou prokyanidiny B1 (epikatechin-(4β→8)-katechin), B2 (epikatechin-(4β→8)-epikatechin), B3 (katechin-(4α→8)-katechin), B4 (katechin-(4α→8)-epikatechin), a na prokyanidiny s interflavonoidní vazbou (4→6) – zde jde o prokyanidiny B5, B6 a B8. Další dobře popsanou skupinou jsou prodelfinidiny (viz obr. 3), které jsou tvořeny dimery obsahujícími společně monomerní jednotky katechinu a galokatechinu, jako je například prodelfinidin B3 (gallokatechin-(4α→8)-katechin) a prodelfinidin B9 (epigallokatechin-(4α→8)-katechin), které byly izolované z piva (Stevens et al., 2002).

Obr. 3 Základní struktura proanthokyanidinů R1, R2 = H, propelar-gonidiny; R1 = H, R2 = OH, prokyanidiny; R1, R2 = OH, prodelfinidiny (Santos-Buelga et al., 2000)

Vzhledem k tomu, že se proanthokyanidiny vyskytují v mnoha druzích rostlin, jsou přítomny také v řadě potravin a nápojů (Es-Safi et al., 2006). Běžně se vyskytují v bobulovitém ovoci (hroznech révy vinné, angreštu, černém a červeném rybízu, jeřabinách, černém bezu), v čaji a v různých ořeších (Prior et al., 2005). Jedním z významných zdrojů proanthokyanidinů je také pivo a sladové nápoje, neboť proanthokyanidiny jsou přirozenou složkou ječmene a chmele. V tab. 1 jsou uvedeny významné zdroje proanthokyanidinů a jejich průměrné koncentrace.

Tab. 1 Průměrný obsah proanthokyanidinů ve vybraných zdrojích (Wu et al., 2004; Gu et al., 2003)

Proanthokyanidiny jsou oceňovány především pro své antioxidační vlastnosti, které jsou dány jejich schopností vychytávat volné radikály a alkyl peroxyl radikály. Jejich přítomnost v potravě a nápojích podporuje ochranu proti kardiovaskulárním onemocněním, imunitním poruchám a neurodegenerativním onemocněním. Biologická aktivita proanthokyanidinů závisí na chemické struktuře, koncentraci a stupni polymerace (Stevens et al., 2002; Hellstrom et al., 2008).

Během technologického procesu výroby piva se proanthokyanidiny obsažené ve chmelu a sladu snadno extrahují do piva díky své vysoké rozpustnosti (Predy et al., 2009). Průměrný obsah proanthokyanidinů v pivu se pohybuje okolo 20 mg.l-1. Odhadované množství proanthokyanidinů, které je závislé na odrůdě chmele, geografickém původu rostliny, na průběhu sklizně a na čerstvosti chmelové suroviny, se pohybuje v rozsahu 0,5–5 % (Li et al., 2006). Dvořáková a kol. (2008) uvedli ve své práci průměrnou sumu proanthokyanidinů a flavan-3-olů v různých odrůdách ječmene a příslušných sladech. Ve sladu byl zjištěn obsah 764 až 1422 mg CE/kg a v původním ječmeni 892 až 2000 mg CE/kg (CE=ekvivalent katechinu). Autoři se domnívají, že je tato skutečnost způsobena tepelnou úpravou ječmene, kdy při sladování dochází k degradaci těchto látek, což má za následek jejich nižší koncentraci v příslušném sladu.

Odhaduje se, že okolo 70–80 % proanthokyanidinů v pivu pochází z ječmene, zatímco pouze 20–30 % pochází z chmele (Stevens et al., 2002). Žádná přesnější studie však dosud nebyla publikována. Podle zatím dostupné literatury jsou proanthokyanidiny z chmele strukturně velmi podobné proanthokyanidinům v ječmeni (sladu), podle těchto pramenů je hlavní rozdíl ve vyšším podílu gallokatechinových oligomerních jednotek v ječmeni.

Obsah polyfenolů v meziproduktech pivovarské výroby a pivu je důležitý pro koloidní stabilitu výrobku. Proteiny, zejména proteiny bohaté na aminokyselinu prolin, tvoří s anthokyanogeny nerozpustné komplexy, které jsou příčinou nežádoucího zákalu piva při jeho skladování (Kadlec et al., 2009). Zákal o nižší intenzitě tvoří komplexy s monomery katechinu a epikatechinu, intenzivnější zákal způsobuje především prokyanidin B3, a zejména prodelfinidin B3 (Kadlec et al., 2009; Siebert et al., 1996).

Z hlediska pozitivního příspěvku proanthokyanidinů k senzorickému profilu piva je jejich vyvážený obsah prospěšný. Tyto látky mají totiž schopnost odstraňovat z piva volné radikály (princip přirozených antioxidantů), a tím zpomalují oxidaci piva, neboli stabilizují jeho organoleptické vlastnosti a zvyšují jeho senzorickou stabilitu (Whittle et al., 1999). Mimoto některé tyto látky ovlivňují plnost piva, trpkost a doznívání hořkosti (Langstaff et al., 1993). Tuto skutečnost je nutno uvážit při stabilizaci piva, neboť neúměrné snížení jejich obsahu může mít vliv na celkový charakter výsledného piva.

Pro separaci a identifikaci struktur analogů proanthokyanidinů bylo v minulosti vyvinuto několik metod. Taylor et al. separoval proanthokyanidiny extrahované z chmele na chromatografické koloně Sephadex LH-20 za použití gradientové eluce s mobilními fázemi tvořenými methanolem, vodou a acetonem (Taylor et al., 2003). Výsledné frakce byly analyzovány pomocí dvoudimenzionální tenkovrstevné chromatografie a gelové permeační chromatografie. Konečná elucidace struktur byla provedena pomocí hmotnostní detekce na MALDI-TOF, pomocí které Taylor popsal oligomerní struktury do stupně polymerace 15.

Magalhãese et al. publikoval práci, ve které popsal separaci katechinu a epikatechinu, a dále objasnil strukturu více než 30 polyfenolických látek zahrnujících kromě proanthokyanidinů také např. xanthohumol a kvercetin. Tyto látky extrahoval z chmele, směs absorboval na PVPP (polyvinylpolyprrolidon), a následně je desorboval směsí aceton/voda (7:3, v/v). Elucidace získaných sloučenin byla provedena pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí (Magalhãese et al., 2010).

Li et al., který použil k identifikaci nově izolovaných proanthokyanidinů ze 13 odrůd chmele metody HPLC-APCI-MS (vysokoúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí, chemická ionizace) a HPLC-ESI-MS (ionizace elektrosprejem), poprvé popsal závislost zastoupení jednotlivých analogů proanthokyanidinů ve vzorku chmele na jeho odrůdě (Li et al., 2006).

Jeho hypotéza byla ověřena ve studii autorů Olšovská et al., kteří potvrdili závislost profilu proanthokyanidinů na odrůdě chmele. Autoři provedli studii na odrůdách českého chmele (Sládek, Premiant, Žatecký poloraný červeňák a Agnus) ze sklizní 2011 (11 vzorků z 9 lokalit) a 2012 (40 vzorků z 24 lokalit). Kromě opakované odrůdové závislosti byla prokázána variabilita profilů v závislosti na lokalitě daného vzorku. Pro získání profilů studovaných látek byla v této práci použita technika UHPLC-TOF-MS (ultraúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí na principu doby letu), srovnávány byly profily 40 proanthokyanidinů s nejvyšším stupněm polymerace 5 Olšovská et al., 2013).

Významnou studii týkající se obsahu a profilu anthokyanogenů v ječmeni provedl kolektiv autorů Whittle et al., který izoloval a identifikoval více než 50 struktur pomocí HPLC-ESI-MS (Whittle et al., 1999). Také Whittle zjistil významnou korelaci mezi profilem analogů proanthokyanidinů a odrůdou ječmene. Vyvinutá metoda však z důvodu časové náročnosti (150 minut) není vhodná pro rutinní stanovení.

Autoři Dvořáková et al. použili techniku HPLC-ESI-MS pro identifikaci monomerních a oligomerních flavan-3-olů v deseti odrůdách ječmene a příslušných sladech (Dvořáková et al., 2008).

Cílem této práce bylo vyvinout rychlou efektivní a reprodukovatelnou metodu pro stanovení proanthokyanidinů v pivu, jeho meziproduktech a surovinách s využitím nejmodernější instrumentální techniky, kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. K detekci byl použit hybridní hmotnostní detektor na bázi kvadrupólu a orbitální pasti. Metoda byla pilotně použita pro zjištění distribuce a chování některých proanthokyanidinů během výrobního procesu a ověření závislosti profilů proanthokyanidinů na chmelové odrůdě.

2 MATERIÁL A METODY

2.1 Chemikálie

• Aceton (99,9%), síran hořečnatý a chlorid sodný (p.a) (Lach:ner, Česká republika).
• Acetonitril (99,9%), methanol (99,9%), kyselina mravenčí (pro LC-MS), probenecid (≥98%) katechin (≥99,0%), epikatechin (≥97,0%), (Sigma-Aldrich, USA).
• Prokyanidin A2 (99,84%), B1 (>95%), B2 (95,38%) (Phytochem, Německo). Dusík (99,996%) (Messer, Německo).
• Deionizovaná voda (vodivost >18 MΩ) (Mill-Q Integral 3, Merck Milipore, USA).

2.2 Příprava roztoků standardů

Zásobní roztoky standardů proanthokyanidinů byly připraveny přesným navážením 1 mg standardu a následným rozpuštěním v 1 ml MeOH. Pracovní roztoky byly připraveny ředěním zásobních roztoků na finální koncentraci 1 mg.l⁻¹. Z pracovního roztoku bylo připraveno deset kalibračních roztoků (pro jednotlivé standardy proanthokyanidinů) tak, že do deseti skleněných vialek se odpipetovalo 2; 5; 10; 20; 50; 100; 200 a 800 μl pracovního roztoku (c = 1 mg.l⁻¹), 100 μl vnitřního standardu (probenecid, c = 1 mg.l⁻¹) a vše bylo doplněno na celkový objem 1 ml roztokem methanol/voda (50:50, v/v). Pracovní roztoky byly připravovány vždy čerstvé. Zásobní roztoky byly uchovávány v mrazáku při -21 °C.

2.3 Příprava vzorků sladiny, mladiny, mladého piva a piva metodou QuEChERS

Vzorky byly odebírány při varním procesu z reprodukovatelných várek lišících se pouze použitou odrůdou chmele. 10 ml vzorku (sladiny, mladiny, mladého piva nebo piva) bylo odpipetováno do plastové 50 ml kyvety (Pozn.: vzorek piva musel být před analýzou vložen na 10 minut do ultrazvukové lázně pro odstranění oxidu uhličitého). Ke vzorku bylo přidáno 10 ml acetonitrilu, kyveta byla důkladně uzavřena a vzorek byl 1 min intenzivně protřepán na třepačce. Následně byla do vzorku přidána směs solí, 4 g MgSO4 a 1 g NaCl, a vzorek byl 1 min intenzivně protřepáván. Vzorek byl následně odstředěn při 5000 min⁻¹ po dobu 7 minut. Po odstředění bylo 300 μl organické fáze odpipetováno do 1,5 ml vialky, přidáno 50 μl vnitřního standardu probenecidu (c = 1 mg.l⁻¹), 600 μl destilované vody a 50 μl 2% mravenčí kyseliny ve vodě pro zvýšení stability proanthokyanidinů. Takto připravený vzorek byl následně dávkován na chromatografickou kolonu.

2.4 Příprava vzorků chmele

Pro získání profilů proanthokyanidinů ve chmelu byly použity vzorky chmele ze sklizně 2014. Vzorky pocházely z různých lokalit České republiky a jednalo se o odrůdy Žatecký poloraný červeňák (ŽPČ), Sládek, Agnus a Premiant. Přibližně 1 g sušených hlávek chmele rozemletých najemno v tříštivém mlýnku byl vložen do Erlenmayerovy baňky společně s 250 ml 70% acetonu s vodou. Volný prostor v baňce byl naplněn dusíkem tak, aby následující extrakce (třepání 40 minut) probíhala v inertní atmosféře. Poté byl vzorek přefiltrován přes skládaný filtr. Z filtrátu bylo odebráno 5 ml vzorku, který byl odpařen dosucha na vakuové odparce při 40 °C. Poté byl odparek v baňce rozpuštěn v 1 ml methanolu. Vzorek pro LC-MS analýzu byl připraven smícháním 200 μl chmelového extraktu s 20 μl vnitřního standardu a 780 μl destilované vody.

2.5 HPLC-HRMS analýza

Vzorky byly analyzovány na HPLC systému Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific) ve spojení s hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (Thermo-Q-Exactive, Thermo Scientific). Pro separaci látek byla použita chromatografická kolona XSELECT HSS T3 (2,1x100 mm, velikost částic 2,5 μm). Mobilní fáze byla tvořena roztoky 0,1% (obj.) mravenčí kyseliny ve vodě (A) a 0,1% (obj.) mravenčí kyseliny v acetonitrilu (B). Eluce probíhala v gradientovém módu (min/B) 0/5, 1/5, 13/70, 18/100, 22-25/5. Celková doba separace byla 25 minut. Teplota kolony byla 40 °C. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml.min⁻¹. Objem vzorku dávkovaný na kolonu byl 2 μl.

MS/MS experiment byl měřen v negativním ionizačním módu, při použitém rozlišení 35000 a izolačním oknu 2 Da. MS/MS data byla získána použitím módu „Data independent acquisition“ (DIA), kdy vybrané hmoty prekurzorů byly fragmentovány v HCD (Higher-Energy Collisional Dissociation) kolizní cele a sledované analyty byly detekovány a kvantifikovány na základě specifických produktových iontů v MS/MS fragmentačních spektrech (viz tab. 2).

Tab. 2 MS parametry pro sledované analyty a skupiny analytů z fragmentačního MSMS spektra (normalizované kolizní energii NCE 30)

Naměřené signály byly zaznamenávány a zpracovány pomocí softwaru Thermo Xcalibur 2.2. Následně byla data exportována do programu OriginPro 8.5 (OriginLab, USA), kde byla dále zpracována.

3 VÝSLEDKY A DISKUZE

3.1 Optimalizace metody

Při optimalizaci metody byla testována hodnota normalizované kolizní energie, s cílem získat MS/MS spektra pro reprodukovanou a správnou kvantifikaci.

Normalizovaná kolizní energie (NCE) byla optimalizována tak, aby získaná MS/MS spektra obsahovala reprodukovatelnou a dobře vypovídající fragmentaci. Z testovaných hodnot NCE 20, 30 a 40 byla jako optimální zvolena hodnota 30, při které byla získána reprodukovatelná MS/MS spektra s bohatou fragmentací. Při použití NCE 20 nedocházelo k dostatečné fragmentaci iontů. Naopak při použití vyšší NCE než 30, docházelo až k příliš rozsáhlé fragmentaci iontů, která byla pro vyhodnocení nepřehledná.

3.2 Interní validace metody

Kalibrace metody byla provedena v koncentračním rozmezí od 5 do 200 μg.l⁻¹. V tomto koncentračním rozsahu byla zjištována linearita signálu hmotnostního detektoru (plochy příslušného píku). Každý bod kalibrační křivky příslušného standardu byl vypočten z šesti opakovaných měření. Ze získaných hodnot ploch, normalizovaných na plochu interního standardu, byly sestrojeny kalibrační křivky a vypočteny rovnice regrese a hodnoty determinačního koeficientu R2, viz tab. 3.

Tab. 3 Kalibrace metody v rozsahu 5 μg.l⁻¹ až 200 μg.l⁻¹, LOQ a jeho RSD %

Z kalibračních křivek byl odvozen limit kvantifikace (LOQ) jako nejnižší bod kalibrační křivky, který splňuje kritérium RSD opakovatelnosti menší než 20 %.

Pro ověření opakovatelnosti metody byl připraven vzorek chmelu (Sládek) šestkrát stejným postupem. Poté byly extrakty změřeny a následně byla vypočítaná koncentrace (mg.kg⁻¹). Ze získaných koncentrací vybraných proanthokyanidinů (katechin, epikatechin, prokyanidin B1 a prokyanidin B2) byla vypočtena relativní směrodatná odchylka průměru RSD %, která vyjadřuje opakovatelnost metody (viz tab. 4). Pro všechny analyzované standardy byla RSD menší než 20 %, což svědčí o dobré opakovatelnosti metody.

Tab. 4Opakovatelnost a výtěžnost metody

Výtěžnost metody byla stanovena tak, že byly určeny hodnoty koncentrací vybraných látek v původním chmelu. Tyto vzorky byly obohaceny roztoky standardů na dvou koncentračních úrovních, a to o koncentracích odpovídajících původní 50% a 100% koncentraci. Z rozdílu obsahu analytů v původním chmelu a chmelu s přídavkem byla vypočtena výtěžnost zvlášť pro každou koncentrační úroveň (50 a 100% přídavku, viz tab. 4). Výtěžnost se na obou koncentračních hladinách pohybovala v rozsahu 98–118 %, což svědčí o dobré výtěžnosti metody. V souladu s již dříve popsanými výsledky je tedy 70% aceton pro extrakci proanthokyanidinů z chmele optimální (Predy et al., 2009; Taylor et al., 2003). Z dobré výtěžnosti metody lze také usuzovat na dobré separační podmínky a podmínky MS detekce.

3.3 Aplikace metody

Optimalizovaná metoda byla použita pro sledování koncentračního profilu flavan-3 olů a proanthokyanidinů (katechin, epikatechin, prokyanidin B1, B2 a B3) během pivovarského varního procesu (obr. 4, 5, 6, 7 a 8). Koncentrační profily katechinu, epikatechinu, prokyanidinu B1 a B2 mají stejný průběh. Ve sladině, kdy jednotlivé proanthokyanidiny pocházejí pouze z ječmene, je koncentrace těchto látek zprvu nízká. Po chmelovaru jejich koncentrace výrazně stoupá, z čehož lze usuzovat, že tyto látky pocházejí převážně z chmele. Následně se v průběhu hlavního kvašení a zrání piva jejich koncentrace snižuje (precipitace s bílkovinami).

Obr. 4 Koncentrační profil katechinu během varního procesu. 1 – modifikace ŽPČ 4979, 2 – modifikace ŽPČ 4980, 3 – ŽPČ, 4 – Kazbek

Obr. 5 Koncentrační profil epikatechinu během varního procesu. 1 – modifikace ŽPČ 4979, 2 – modifikace ŽPČ 4980, 3 – ŽPČ, 4 – Kazbek

Obr. 6 Koncentrační profil prokyanidinu B1 během varního procesu. 1 – modifikace ŽPČ 4979, 2 – modifikace ŽPČ 4980, 3 – ŽPČ, 4 – Kazbek

Obr. 7 Koncentrační profil prokyanidinu B2 během varního procesu. 1 – modifikace ŽPČ 4979, 2 – modifikace ŽPČ 4980, 3 – ŽPČ, 4 – Kazbek

Obr. 8 Koncentrační profil prokyanidinu B3 během varního procesu.1 – modifikace ŽPČ 4979, 2 – modifikace ŽPČ 4980, 3 – ŽPČ, 4 – Kazbek

Rozdílný průběh má koncentrační profil prokyanidinu B3, jehož koncentrace je nejvyšší ve sladině, a poté lineárně klesá. Z této závislosti lze vyvodit, že prokyanidin B3 není obsažen ve chmelu.

Dále je z grafů patrné, že koncentrace katechinu v mladině (obr. 4) je při chmelení různými odrůdami chmele rozdílná. Koncentrace epikatechinu v mladině (obr. 5) se shoduje u odrůdy Kazbek s chmelem 4980 (modifikace ŽPČ). Koncentraci prokyanidinu B1 v mladině má shodnou chmel 4979 (modifikace ŽPČ) a ŽPČ. Prokyanidin B2 v mladině má stejnou koncentraci v obou vzorcích modifikace ŽPČ 4979 a 4980; tyto vzorky obsahují asi pětinásobně vyšší koncentraci B2 oproti odrůdě Kazbek. Malý rozptyl obsahu B3 v mladině (obr. 8) je dán nejistotou měření a technologií přípravy vzorku.

Podobně jako dříve popsané metody (Olšovská et al., 2013; Li et al. 2006) byla vypracovaná metoda také použita pro sledování odrůdové specifity chmele na základě skupin proanthokyanidinů, které jsou uvedeny v tab. 3. Získané profily testovaných padesáti vzorků chmele byly statisticky zpracovány.

Výsledky klastrové analýzy relativního zastoupení monomerních jednotek a oligomerů, proanthokyanidinů (obr. 9) zcela jasně odlišily odrůdy chmele, a to i z pohledu genetické příbuznosti odrůd. České odrůdy s podílem ŽPČ v genomu se od tohoto tradičního chmele odlišují méně nežli odrůdy vzdálené. Geneticky vzdálené jsou odrůdy Kazbek a Agnus, které se řadí do skupiny amerických chmelů (Atlas českých odrůd chmele, 2012). Kazbek má v původu plané kavkazské chmele, Agnus odrůdy ŽPČ, Sládek, Bor, Fuggle a Northern Brewer. Bližší ŽPČ jsou odrůdy chmele Sládek a Premiant. Obě tyto odrůdy mají v původu významný podíl ŽPČ. Je zřejmé, že genetický původ chmele koresponduje s chemotaxonomickým profilem proanthokyanidinů chmele. Výsledky získané novou metodou plně potvrdily závěry předchozí studie (Olšovská et al., 2013).

Obr. 9 Klastrová analýza. Odrůdová specifita chmele (ZPC – Žatecký poloraný červeňák, SLA – Sládek, PRE – Premiant, AGN – Agnus, KAZ – Kazbek)

4 ZÁVĚR

Cílem této práce bylo optimalizovat podmínky separace proanthokyanidinů ve vybraných pivovarských surovinách pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením a následně tuto metodu využít pro sledování profilu vybraných proanthokyanidinů (katechin, epikatechin, prokyanidin B1, B2 a B3) během pivovarského procesu. Byl potvrzen předpoklad, že jednotlivé koncentrace se během procesu mění. Koncentrace katechinu, epikatechinu, prokyanidinu B1 a B2 v mladině prudce stoupla oproti koncentraci ve sladině, z čehož vyplývá, že tyto látky jsou při varním procesu extrahovány z použitého chmele. Naopak prokyanidin B3 pochází pouze z ječmene, neboť jeho koncentrace během varního procesu lineárně klesá. Výsledný pokles všech sledovaných PAs je způsobený technologickým procesem při výrobě piva (precipitace s bílkovinami a následné odstraňování kalů). Dále bylo potvrzeno, že profil proanthokyanidinů je specifický pro danou odrůdu českého chmele.