Analýza polyfenolů v pivovarských surovinách s využitím PSE (Pressurized Solvent Extraction) - tlakové extrakce rozpouštědlem a metodou HPLC s CoulArray detekcí

Moderní extrakční technika PSE (Pressurized Solvent Extraction) – tlaková extrakce rozpouštědlem ve spojení s HPLC s vysoce citlivým elektrochemickým detektorem CoulArray – představuje pokrok v analýze polyfenolů v pivovarských surovinách. Simulaci extrakčního procesu chmelovaru nebo rmutování by bylo metodou PSE možné realizovat pomocí „markerů“, které se oběma postupy extrahují prakticky stejně. Metoda PSE pro zhodnocení totálního obsahu jednotlivých polyfenolů ve sladu i chmelu je vhodnější. Variabilita extrakčních podmínek umožňuje snadno najít podmínky pro maximální výtěžnost. Pro většinu sledovaných polyfenolů při tlaku 150 bar byla nejúčinnější teplota 140 °C, avšak pro nejvíce zastoupenou kyselinu ferulovou (ve sladu i v nejvyšších koncentracích) se jeví jako vhodnější teplota 40 °C ve sladu i chmelu.

1 ÚVOD

Pivovarské suroviny chmel a slad jsou cenným zdrojem polyfenolických sloučenin, jejichž antioxidační vlastnosti jsou již řadou studií prokázány. Polyfenoly v pivu zpomalují jeho stárnutí, při jeho konzumaci polyfenoly působí příznivě na lidský organismus zapojováním do antioxidačních procesů.

Z pivovarského hlediska je důležitá znalost složení a zastoupení jednotlivých polyfenolů ve vstupních surovinách a jejich skutečný podíl, který do piva přejde.

Z důvodu získání výsledků co nejvěrněji popisujících skutečný příspěvek polyfenolů ze sladů do piva je extrakční proces totožný s přípravou kongresní sladiny, v níž se polyfenoly dále analyzují. Polyfenoly pocházející z chmele jsou z téhož důvodu analyzovány ve vodním výluhu po chmelovaru.

Tyto extrakční procesy jsou však časově náročné a neposkytují skutečný obraz zastoupení jednotlivých polyfenolických složek v matrici sladu nebo chmele. Přímé extrakční metody polyfenolů do organických rozpouštědel jsou také experimentálně náročné, ale naopak neposkytují informaci, jaké bude jejich složení v pivu v závislosti na technologickém procesu.

Extrakční metoda PSE může využívat k extrakci vodu nebo vodu modifikovanou organickým rozpouštědlem. Kombinací extrakčních teplot a tlaků lze ovlivnit extrakční stupeň, od částečného vyextrahování matrice, až po její úplné vyextrahování. Extrakce je velmi rychlá, s malými nároky na organická rozpouštědla, extrakce jsou cenově méně nákladné a odpadá problém s likvidací organických rozpouštědel.

Nabízí se proto otázka, zda lze díky variabilnosti systému najít simulaci extrakcí varního procesu nebo rmutování. Naopak informace o složení suroviny při jejím totálním vyextrahování mohou být cennou informací i pro jiné oblasti zpracování chmele a sladu.

Extrakční technika PSE není dosud příliš rozšířena a používá se zejména v oblasti analýzy kontaminantů v rostlinných materiálech (1) a potravinách (2,3). Užití vysokých teplot a tlaků vede k vyšším výtěžnostem, než poskytují klasické extrakční techniky (4). Úspěšné použití PSE techniky bylo realizováno v oblasti extrakcí isoflavonoidů (5).

V této studii byly extrahovány polyfenoly ze sladu a chmele při tlaku 150 bar a byla sledována extrakční účinnost v závislosti na extrakční teplotě v rozsahu 40–140 °C. Polyfenoly byly analyzovány metodou HPLC s CoulArray detekcí (6). Získané výsledky byly porovnávány s hodnotami koncentrací polyfenolů stanovených ve chmelovém extraktu po chmelovaru a ve sladovém extraktu po rmutování.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Materiál a metody

2.1.1 Chemikálie

Kyselina gallová, kyselina 3,4-dihydroxybenzoová, kyselina 2,6-dihydroxybenzoová, kyselina p-hydroxybenzoová, eskulin, kyselina 4-hydroxyfenyloctová, kyselina vanilová, kyselina chlorogenová, (+)-katechin, kyselina kávová, kyselina p-kumarová, kyseliny syringová, vanilin, umbelliferon,(-)-epikatechin, skopoletin, ferulová kyselina, sinapová kyselina, 4-hydroxykumarin, rutin, naringin, myricetin, kvercetin, apigenin, biochanin A, daidzein, genistein, formononetin (Fluka).

Acetonitril pro gradient (Merck), voda pro HPLC (Millipore, USA), octan amonný, kyselina mravenčí, methanol pro gradient (Merck).

2.1.2 Extrahovaný materiál

Extrakční pokusy byly prováděny se sladem Prestige a chmelem Žateckým poloraným červeňákem.

2.1.3 Příprava vzorků

Pro extrakce polyfenolů byl použit OnePSE automatizovaný extraktor (Applied Separations Inc., USA). Extrakce probíhala za tlaku 150 bar při teplotách 40, 60, 80, 100, 120 a 140 °C v ocelových extrakčních patronách. 1,5 g (vážení s přesností 0,1 mg) rozemletého vzorku bylo smícháno s inertním materiálem balotinou a naplněno do extrakční cely. K extrakci byla použita voda pro HPLC (Millipore, USA), extrakční cyklus proběhl třikrát. Extrakční cela byla mezi cykly a na konci extrakce vymyta dusíkem. Získané extrakty byly jímány do 50 ml odměrek a doplněny po rysku mobilní fází A pro HPLC analýzu. Přehled extrakčních podmínek podává tab. 1.

Tab. 1 PSE podmínky pro slad a chmel

Vedle tlakových extrakcí byly provedeny srovnávací extrakce jak pro slad, tak pro chmel.

Klasická extrakce pro slad: 50 g sladu bylo extrahováno do vody formou sladiny. Sladina byla vyvážena do 450 g vodou.

Klasická extrakce chmele: 1,25 g namletého chmele bylo vařeno pod zpětným chladičem 30 minut. Horký extrakt byl filtrován přes skládaný filtr a doplněn do 250 ml vodou.

Sladový i chmelový extrakt byly vždy zředěny mobilní fází A v poměru 1:1.

2.1.4 HPLC chromatografie

Polyfenolické vzorky byly analyzovány metodou HPLC s elektrochemickou detekcí.

Systém se skládal ze 2 čerpadel model 582, dávkovače model 542 a CoulArray detektorem model 5600 A (ESA Inc., USA). Elektrochemický detektor CoulArray je vybaven osmi elektrochemickými celami z porézního grafitu, seřazenými za sebou, paladiovou referenční elektrodou a platinovou pracovní elektrodou. Jedná se o detektor destruktivní, neboť analyt prochází řadou elektrod s postupně vzrůstajícím vloženým potenciálem a při potenciálu charakterizujícím obtížnost/snadnost oxidace v systému je kompletně zoxidován.

Analyty byly separovány na koloně Synergi-Hydro RP 3,0x150 mm, zrnění 4μm (Phenomenex, USA).

Separační podmínky: Vzhledem k velké odlišnosti polarity extrahovaných polyfenolů byly vzorky extraktů postupně analyzovány dvěma HPLC metodami, s odlišným elučním binárním gradientem acetonitrilu s průtokem 0,8 ml/min a teplotě kolony 35 °C. Mobilní fáze byla tvořena 0,005 M octanem amonným (složka A) a acetonitrilem (složka B), pH bylo adjustováno na hodnotu 3,0 kyselinou mravenčí.

Pro polárnější volné polyfenolické kyseliny, katechin, epikatechin a kumarin (obr. 1) byly použity mobilní fáze A (5 % ACN) a fáze B (50 % ACN) s gradientem: 0–10 min. 0 % B, 10–18 min. 0–8 % B, 18–40 min. 8–10 % B, 40–77 min. 10–21 % B, 77–90 min. 21–52 % B. Po analýze byla kolona po dobu 10 minut promývána 100% fází B a po 15 min ekvilibrace kolony byl nastříknut další vzorek (chromatografická metoda I).

Obr. 1 Chromatogram standardů (1 mg/l), metoda I

Pro méně polární flavonoidy a isoflavonoidy (obr. 2) byly použity mobilní fáze A (14 % ACN), fáze B (50 % ACN) s gradientem: 0–30 min. 0–57 % B, 30–50 min. 57 % B, 50–70 min. 100 % B, 70–80 min. 100 % B. Po skončení analýzy kolonou protékalo ještě 2 minuty 100% fáze B, poté následovala ekvilibrace kolony 100 % fází A po dobu 17 min (chromatografická metoda II).

Obr. 2 Chromatogram standardů (1 mg/l), metoda II

Polyfenoly opouštějící kolonu byly detekovány při průchodu řadou elektrod z porézního grafitu v CoulArray detektoru. Na jednotlivých elektrodách se vzestupně vloženým potenciálem 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800 a 900 mV byl měřen odpovídající proud a prošlý náboj vznikající při oxidaci polyfenolů na všech elektrodách a zaznamenán jako eluční zóna chromatogramu. Nejvyšší odezva (dominantní pík) byla použita pro kalibraci a stanovení každého analytu.

2.1.5 Kalibrační standard

Byl připraven směsný standard navážením kolem 10 mg s přesností 0,1 mg každé sloučeniny do 100 ml odměrky a rozpuštěním v methanolu. Tento zásobní roztok byl uchováván v mrazničce při –4 °C po dobu max. 3 měsíců. Kalibrační roztoky byly pak připraveny na koncentračních úrovních 1,0; 0,5; 0,1 a 0,01 mg/l ředěním zásobního roztoku do 100 ml odměrek fází A pro oba separační postupy.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

3.1 Slad

Opakovanými pokusy bylo zjištěno, že výtěžnost extrakce PSE jen u některých polyfenolů obsažených ve sladu (obr. 3) závisí na extrakční teplotě v celém rozsahu aplikovaných teplot, zatímco u většiny sledovaných polyfenolů se výraznější teplotní závislost extrakce projevuje až od teploty 120 °C (obr. 4, 5).

Obr. 3 Polyfenoly s výtěžností extrakce závislé na teplotě

Obr. 4 Polyfenoly bez závislosti výtěžnosti extrakce na teplotě

Obr. 5 Polyfenoly bez závislosti výtěžnosti extrakce na teplotě

Hlavní marker polyfenolů ve sladu, kyselina ferulová, která vykazuje vždy nejvyšší obsah ve skupině sledovaných polyfenolů, má svoje maximum výtěžnosti paradoxně při nejnižší extrakční teplotě. Nestandardní chování vykazuje též kyselina p-hydroxybenzoová s dvěma extrakčními maximy při 80 °C a 120 °C. Obr. 4 a 5 demonstrují chování eskulinu, jehož extrakční maximum bylo dosaženo při 60 °C, a daidzeinu, jehož extrakční maximum odpovídalo teplotě 80 °C. K úplnému vyextrahování sledovaných polyfenolů dochází při 140 °C s výše uvedenými výjimkami.

Přehledné výsledky extrakce ze sladu podává tab. 2. Hodnoty zjištěných koncentrací ve sladu při použitých extrakčních teplotách jsou porovnány s hodnotami nalezenými ve sladu při použité extrakci rmutováním. Je zřejmé, že jen u některých polyfenolů (4-hydroxyfenyloctová kyselina, (+) katechin, p-kumarová kyselina, ferulová kyselina a rutin) lze najít teplotní oblast tlakové extrakce, v níž se svými výsledky blíží výsledkům získaným při rmutování. Pro screening kvality sladu pro pivovarské účely z hlediska obsahu polyfenolických sloučenin přecházejících do piva by tento extrakční postup mohl být vhodný, uvedené sloučeniny by mohly být považovány za markery extrakčního procesu. Výsledky ale také naznačují, že skutečný obsah polyfenolických látek ve sladu může být daleko vyšší (např. kvercetin, kyselina chlorogenová a kávová), než kolik jich je zjištěno pomocí rmutovacího procesu.

Tab. 2 Porovnání výsledků PSE extrakce a extrakce rmutováním u sladu Prestige

3.2 Chmel

Bylo zjištěno, že extrakční výtěžnost z matrice chmele je na extrakční teplotě při PSE metodě v rozsahu teplot 40–100 °C nezávislá. Hodnoty koncentrací jednotlivých polyfenolů ve chmelové matrici nalezené pomocí PSE při různých teplotách jsou uvedeny na obr. 6, 7 a 8. Porovnání s hodnotami zjištěnými extrakčním postupem chmelovaru je v tab. 3.

Obr. 6 Polyfenoly chmele z PSE nalezené v nižších koncentracíchs použitím chromatografické metody I

Obr. 7 Polyfenoly chmele z PSE nalezené ve vyšších koncentracíchs použitím chromatografické metody I

Obr. 8 Méně polární polyfenoly získané PSE extrakcí analyzovanéchromatografickou metodou II

Tab. 3 Porovnání výsledků PSE extrakce a extrakce horkou vodou u vzorku chmele

Pro p-hydroxybenzoovou kyselinu, (+)-katechin, chlorogenovou kyselinu, (-)-epikatechin byla nalezena řádová shoda stanovených koncentrací ve chmelu při postupu PSE a postupu vodního výluhu do horké vody (= při chmelovaru), avšak vyšší výtěžnost stanovení byla zjištěna u vzorků z chmelovaru. U ferulové kyseliny je opět výtěžnost při PSE extrakci vyšší, avšak nejedná se o výrazný rozdíl. Tyto uvedené polyfenoly by opět mohly být považovány za markery kvality chmele pro pivovarské účely vzhledem k obsahu polyfenolů. Tabulka 3 dále přehledně podává informaci o ostatních polyfenolických sloučeninách nalezených ve chmelu. Je zřejmé, že metodou PSE lze vyextrahovat všechny ostatní sledované polyfenolické sloučeniny z chmele na rozdíl od extrakce do horké vody. Nelze však najít jednoznačný vztah mezi množstvími nalezenými PSE extrakcí a extrakcí chmelovarem. Například myricetin a kvercetin byly stanoveny postupem chmelovaru v koncentracích 408 resp. 254,8 mg/kg ve chmelu, ale extrakční metodou PSE byly tyto látky nalezeny pouze v koncentracích 12,55 resp. 4,10 mg/kg chmele. Polyfenoly kyselina vanilová, kyselina kávová, kyselina p-kumarová, umbeliferon a 4-hydroxykumarin u daného chmele nebyly chmelovarem extrahovány, ale metodou PSE byly nalezeny v koncentracích jednotek, desítek i stovek mg/kg ve chmelu.