Chmel – bohatý zdroj antioxidantů. Metody k posouzení antioxidační aktivity chmelové matrice

Látky se stejným elektrochemickým chováním jako epikatechin a katechin a od nich odvozené oligomerní proanthokyanogeny (OPC) bylo možné na základě nižších reakčních potenciálů (500 mV) odlišit od ostatních elektrochemicky aktivních sloučenin. Celkový obsah těchto OPC včetně katechinu a epikatechinu byl stanoven jako ekvivalent koncentrace katechinu užitého jako externího standardu. Výsledky byly korelovány jednak s hodnotami skupinových analýz pro stanovení celkových polyfenolů a pro stanovení anthokyanogenů, jednak s výsledky získanými moderní metodou elektronové spinové resonance (ESR – DPPH).

1 ÚVOD

Chmel (Humulus lupulus L.), rostlina z čeledi Cannabinaceae, kromě základních látek dodávajících vyrobenému pivu základní senzorické charakteristiky (hořkost, vůni a plnost) obsahuje i řadu dalších látek se zdravotním významem. Jedná se zejména o skupinu dimerů a trimerů, antioxidantů (1) odvozených od katechinu a epikatechinu, tzv. oligomerní proanthokyanogeny (OPC), a skupinu prenylovaných flavonoidů (2,3), z nichž nejvíce zastoupený je xanthohumol (tvoří 0,25–1,1 % hm.).

Obě skupiny látek mají schopnost léčivě působit na lidské zdraví nebo bránit vzniku chorob. Skupina antioxidantů OPC s nižšími potenciály potřebnými pro proběhnutí jejich oxidace chrání zejména buněčnou DNA před její oxidací, a tím brání organismus před vznikem řady civilizačních chorob, zejména nádorových onemocnění (4). Skupina prenylflavonoidů se chová především tak, že je vnímána receptory v lidském organismu jako hormon estrogen, tyto látky tedy mají estrogenní účinky (5, 6). Estrogenní aktivita těchto látek je využívána zejména ke zmírnění zdravotních potíží žen v období klimakteria, vrací organismus do normálního stavu, dále jsou tyto látky účinné při léčbě osteoporózy. Tyto látky na rozdíl od OPC mají vyšší oxidační potenciál, takže se na antioxidačních procesech podílejí menší měrou (daidzein a genistein) a jejich těžiště spočívá spíše v interakcích s tkáňovými receptory (7) ovlivňujícími estrogenní účinky a buněčné dělení.

Elektrochemická detekce CoulArray detektoru umožňuje rozlišit skupiny elektrochemicky aktivních látek na základě jejich voltametrického chování, a tak docílit dostatečné selektivity a sledovat jen určitou skupinu látek (8). Je tedy možné odlišit látky s nižšími oxidačními potenciály (400-500 mV), např. katechin a od něj odvozené OPC od látek vyžadujících vyšší oxidační potenciál, např. kyselina ferulová (700 mV) nebo kyseliny p-hydroxybenzoová a 4-hydroxyfenyloctová (900 mV) (8).

Tato studie byla zaměřena na stanovení antioxidační aktivity oligomerních proanthokyanidinů chmelu metodou kapalinové chromatografie s CoulArray detekcí a porovnání získaných výsledků s hodnotami stanovenými jednak moderní metodou elektronovou spinovou rezonancí (ESR), jednak klasickými metodami pro stanovení celkových polyfenolů a stanovení anthokyanogenů.

2 MATERIÁL A METODY

Předmětem studie byly chmely Harmonie, Rubín a nové odrůdy chmelů označené 4816, 4849 a 5008. Vzhledem k dostatečné polaritě oligomerních proanthokyanidinů a jejich dobré rozpustnosti ve vodě, byly použity studené výluhy chmele.

Z důvodu komplikovanosti a dosud neznámé chemické struktury jednotlivých složek frakce oligomerních proanthokyanidinů ve chmelu byla zvolena pro hodnocení technika fingerprintu, kde společným jmenovatelem všech složek je stejný oxidační potenciál (500 mV) s vymezením oblasti, v níž se tyto látky eluují mezi 20. a 40. minutou (obr. 1). Koncentrace všech OPC byla vyjádřena jako ekvivalent odpovídající koncentraci katechinu, případně epikatechinu, které byly použity pro kalibraci. Takto zjištěné hodnoty byly korelovány s hodnotami změřenými pro antioxidační aktivitu metodou (ESR – DPPH) a klasickými metodami pro stanovení celkových polyfenolů a stanovení anthokyanogenů.

Obr. 1 Chromatogram měřené frakce OPC

Pro všechny zkoušené metody byl připraven studený výluh: 5 g namletého chmele mícháním v 250 ml destilované vody za laboratorní teploty po dobu 30 minut. Výluh byl odstředěn (15 min, 10 000 ot/min) a uchován zamražením pro analýzy.

HPLC

Příprava vzorku k analýze

Chmelový výluh se zředí v poměru 1:1 s mobilní fází A (viz chromatografická separace) a přefiltruje přes celulosový filtr 0,20 μm (Chromafil RC-20/25 Macherey Nagel) protlačením vzorku injekční stříkačkou do vialek pro analýzu.

Chromatografické podmínky

Základem mobilních fází A a B byl 0,005M octan amonný (Fluka) v ultračisté vodě, TOC< 5 ppb (Millipore). Fáze A obsahovala 5 % acetonitrilu (pro gradient, Sigma Aldrich), fáze B obsahovala 50% acetonitrilu stejné kvality. Obě fáze byly přefiltrovány přes filtr o velikosti pórů 0,2 μm a kyselinou mravenčí (Fluka) bylo upraveno pH na hodnotu 3,00. Čistota chemikálií byla pro MS aplikace.

Kolona

• Purospher STAR RP-18e (5 μm), 250 x 4,6 mm (Merck).
• Gradient: 0–10 min. 0% B, 10–18 min. 0–8% B, 18–40 min. 8–10 % B, 40–77 min. 10–21% B 77–120 min. 21–85% B. Poté zvýšení na 100% B, vyčištění cel a 15 min. ekvilibrace.
• Teplota kolony: 35 °C
• Průtok: 0,8 ml/min
• Nástřik 10 μl
• Nastavené potenciály: 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mV.

Kalibrace

Katechin byl zvolen jako ekvivalent pro vyjádření koncentrace všech antioxidačních látek se stejnou aktivitou, tj. reagujících na stejném potenciálu (500 mV). Byla provedena externí kalibrace standardními roztoky katechinu o koncentracích 0,01; 0,1; 0,5; 1,0 a 5,0 mg/l na základě měření výšek píků. Stanovení OPC bylo provedeno na základě měření a sečtení výšek všech píků odpovídajících elektrochemickými vlastnostmi katechinu ve sledovaném intervalu. Koncentrace OPC byla pak vyjádřena jako koncentrace katechinu (mg/l).

Stanovení antioxidační aktivity DPPH

Antioxidační aktivita jednotlivých chmelů byla stanovena technikou elektronové spinové rezonance (ESR). Metoda je založena na reakci stabilního volného radikálu 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu (DPPH) s antioxidanty přítomnými v měřeném vzorku. Antioxidační aktivita vzorků (ARA 2) je vyjádřena jako relativní pokles koncentrace DPPH po 10 minutách reakce.

Všechna měření volných radikálů byla provedena na spektrometru MiniScope MS 200 firmy Magnettech GmbH, Germany.

Vlastní stanovení: ke 14 ml činidla DPPH se přidá 1 ml vzorku, směs se okamžitě promíchá, vloží do autosampleru vyhřátého na 30 °C. Ihned se spustí příslušný měřící program, který řídí transport reakční směsi v minutových intervalech do měřící kyvety spektrometru. Hodnota signálu volného radikálu DPPH je zaznamenávána po dobu 10 minut. Po ukončení analýzy jsou naměřené hodnoty zpracovány pomocí matematického programu spektrometru. Výsledkem je časová závislost hodnoty ESR-signálu DPPH. Antioxidační aktivita ARA2 je vyjádřena v procentech úbytku hodnoty DPPH po 10 minutách reakce.

Stanovení celkových polyfenolů

Celkové polyfenoly byly stanoveny podle Analytiky EBC (10).

Stanovení anthokyanogenů

Anthokyanogeny byly stanoveny podle Pivovarsko-sladařské analytiky (11).

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Byla zjištěna korelace výsledků stanovených popsanou metodou HPLC s elektrochemickou detekcí pro skupinu látek oligomerních proanthokyanidinů a výsledků změřených metodami: ESR – DPPH pro antioxidační aktivitu (R2 = 0,9412), pro celkové polyfenoly (R2 = 0,9867) a pro anthokyanogeny (R2 = 0,991). Grafické vyjádření korelací se srovnávanými metodami podávají obr. 2, 3, 4. Koeficienty determinace R2 byly vypočítány statistickým programem Microsoft Office Excel 2003.

Obr. 2 Elektrochemická metoda s CoulArray detekcí v porovnání s metodou ESR-DPPH pro kvantitativní vyjádření antioxidační aktivity matrice

Obr. 3 Elektrochemická metoda metoda sCoulArray detekcí v porovnání s metodou pro stanovení celkových polyfenolů jako míra antioxidačního

Obr. 4 Elektrochemická metoda metoda s CoulArray detekcí v porovnání s metodou pro stanovení anthokyanogenů jako míra antioxidačního

Nově vypracovaná chromatografická metoda s elektrochemickou detekcí může být použita pro porovnání antioxidační aktivity chmelů a chmelových preparátů vedle již používané moderní ESR-DPPH pro stanovení antioxidační aktivity a klasických metod pro stanovení celkových polyfenolů a anthokyanogenů pro hodnocení antioxidační aktivity komplexních matric. Nejtěsnější shody (R2 = 0,991) bylo dosaženo s metodou pro stanovení anthokyanogenů, tedy skupiny sloučenin svou strukturou i povahou substituentů na benzenovém jádře velmi podobných katechinům a jejich oligomerům. Korelační koeficienty s ostatními metodami svědčí o uplatnění i jiných struktur s antioxidační povahou, přesto hodnoty jejich korelace 0,9867 a 0,9412 vypovídají o poměrně dobré shodě. Z toho lze usuzovat, že látkami zodpovědnými za antioxidační vlastnosti chmele jsou katechiny, oligomery katechinů a anthokyanogeny. Ostatní struktury v důsledku vyšších oxidačních potenciálů antioxidační aktivitu ovlivní méně výrazně, např. již zmíněné kyseliny ferulová, p-hydroxybenzoová nebo 4-hydroxyfenyloctová.