Chromatogramy extrahovaných iontů v LC-MS/MS

Chromatogramy extrahovaných iontů patří mezi nejdůležitější nástroje pro interpretaci LC–MS dat. Chromatogram extrahovaného iontu (XIC, Extracted Ion Chromatogram) sleduje intenzitu zvolené hodnoty m/z v průběhu retenčního času. Výsledý záznam ukazuje, kdy daný ion eluuje z LC kolony, a obvykle se projeví jako chromatografický pík.

XIC se tradičně využívají především ke kvantifikaci. Po identifikaci sloučeniny na základě jejího MS/MS spektra se z MS1 dat extrahuje odpovídající prekurzorový ion a plocha nebo výška vzniklého píku se použije k odhadu jeho abundance.

Postup představený Jamesem Littlem v materiálu Theoretical and Practical Understanding of XICs tuto úlohu výrazně rozšiřuje. V přístupu založeném na XIC, implementovaném v nástrojích NIST26 MS/MS Chromatogram, není chromatogram pouze výsledkem předchozí identifikace. Stává se dalším zdrojem informací, který může navrženou identifikaci potvrdit, opravit nebo zpochybnit.

Co XIC představuje?

XIC vzniká výběrem konkrétního iontu – případně definovaného rozsahu kolem daného iontu – a vykreslením jeho naměřené intenzity v průběhu chromatografické analýzy.

Výsledný pík může poskytovat informace o:

• retenčním čase detekované komponenty,
• tvaru a šířce chromatografického píku,
• počtu MS1 skenů tvořících pík,
• MS/MS spektrech získaných během eluce komponenty,
• integrované ploše píku,
• poměru signálu k šumu a úrovni pozadí,
• pozorované izotopové distribuci,
• shodě mezi experimentálním a teoretickým izotopovým profilem.

XIC tedy obsahuje podstatně více informací než jedinou hodnotu intenzity. Propojuje prekurzorový ion, chromatografické chování, izotopový profil a související tandemová hmotnostní spektra.

Ve postupu uvedeném v prezentaci jsou MS/MS spektra, která spadají do uživatelem definované tolerance pro danou chromatografickou komponentu, seskupena do jednoho XIC binu. Jeden XIC pík tak může být spojen s několika MS/MS spektry získanými v různých částech píku.

Od jednosměrného workflow k validaci založené na XIC

Konvenční vyhledávání LC–MS/MS spekter v knihovnách obvykle probíhá jedním směrem:

MS/MS spektrum → shoda v knihovně → navržená identifikace → extrakce XIC pro kvantifikaci

Jakmile knihovní vyhledávání poskytne identifikaci, XIC se využije především ke stanovení množství detekované sloučeniny.

Postup založený na XIC je naopak obousměrný:

MS/MS spektrum → předběžná identifikace → extrakce XIC → chromatografické a izotopové vyhodnocení → potvrzení nebo korekce identifikace

Proces popsaný v prezentaci zahrnuje několik kroků:

1. MS/MS spektrum je porovnáno se spektrální knihovnou.
2. Z MS1 dat je extrahován prekurzorový ion.
3. Jsou shromážděny signály související s chromatografickým píkem.
4. Přes celý pík je rekonstruován izotopový profil.
5. Pozorovaná izotopová obálka je porovnána s teoretickým profilem.
6. Navržená identifikace je potvrzena nebo opravena.

MS1 a MS/MS data tak nejsou interpretována jako dva oddělené zdroje informací, ale vzájemně se doplňují. MS/MS spektrum poskytuje strukturální informace, zatímco XIC přidává retenční chování, kontext chromatografického píku, konzistenci izotopového profilu a informace ze všech relevantních skenů.

Tento přístup může pomoci odhalit chybné přiřazení monoisotopického iontu, omezit falešně pozitivní identifikace a zlepšit reprodukovatelnost stanovení abundance.

Důležité vlastnosti XIC v tabulce výsledků

Chromatografické okno NIST přidává k výsledkům knihovního vyhledávání několik vlastností souvisejících s XIC. Zvláště důležité jsou čtyři položky.

XIC Number

XIC Num. označuje pořadové číslo přiřazené píku dané komponenty. Spektra patřící ke stejné chromatografické komponentě obdrží stejné číslo XIC.

Pokud několik řádků výsledků sdílí stejné číslo XIC, představují MS/MS spektra spojená se stejným píkem extrahovaného iontového chromatogramu, nikoli nezávislé chromatografické komponenty.

nSpec

nSpec udává počet MS/MS spekter přiřazených k danému XIC píku.

Hodnota sedm například znamená, že v rámci uživatelem definované tolerance pro danou komponentu bylo získáno sedm MS/MS spekter. Kontrola všech sedmi spekter může ukázat, zda navržená identifikace zůstává konzistentní v celé šířce chromatografického píku.

Iso.Profile

Iso.Profile vyjadřuje míru shody mezi pozorovanou izotopovou distribucí a teoretickým izotopovým profilem očekávaným pro navržené složení.

Hodnoty blízké jedné znamenají velmi dobrou shodu. Nižší shoda může upozorňovat na interferenci, nesprávný molekulový vzorec, chybné monoisotopické přiřazení nebo jiný problém vyžadující podrobnější kontrolu.

Width

Width popisuje chromatografickou šířku XIC komponenty v sekundách.

Reálná nenulová šířka podporuje interpretaci signálu jako chromatografického píku tvořeného několika skeny. Nulová šířka je důležitým varovným signálem, protože často znamená, že výsledek pochází pouze z jediného skenu a nemohl být zpracován jako běžný XIC pík.

Proč je nastavení „Best Hits“ důležité

Volba Best Hits určuje, zda se v seznamu výsledků zobrazí všechna MS/MS spektra prohledaná v knihovně, nebo pouze jedno reprezentativní spektrum z každého XIC binu.

Pokud je Best Hits vypnuto, zobrazí se všechna prohledaná MS/MS spektra. V příkladu uvedeném v prezentaci výsledný seznam obsahoval 158 záznamů. K XIC píku látky Aminocarb bylo přiřazeno sedm spekter.

Zobrazení všech spekter je užitečné, protože knihovní shoda nemusí být u každého MS/MS spektra v rámci stejného XIC binu totožná. Spektra získaná na začátku píku, v jeho apexu a na konci se mohou lišit intenzitou signálu, mírou interferencí nebo skóre knihovního vyhledávání.

Pokud je Best Hits zapnuto, software zobrazí z každého XIC binu pouze spektrum s nejvyšším skóre knihovního vyhledávání. Ostatní spektra spojená s daným píkem jsou z hlavního seznamu výsledků vynechána.

Prezentace uvádí, že NIST mohl všechna spektra v rámci XIC binu zprůměrovat a následně prohledávat výsledné průměrné spektrum. Studie citované v prezentaci však ukázaly, že použití jednotlivého spektra s nejvyšším skóre přináší lepší výsledky než vyhledávání průměrného spektra.

Praktickým postupem je proto při prvotním vyhodnocování dat začít s vypnutou funkcí Best Hits. Lze tak posoudit konzistenci všech spekter. Následně je možné Best Hits zapnout a získat stručnější seznam s jedním reprezentativním výsledkem pro každou chromatografickou komponentu.

Jak otevřít XIC Analyzer

Komponentu lze do XIC Analyzeru odeslat dvěma způsoby:

1. Kliknout pravým tlačítkem na odpovídající položku v tabulce výsledků.
2. Zvolit Send To → XIC Analyzer.

Stejný příkaz lze otevřít kliknutím pravým tlačítkem na vybranou komponentu v celkovém iontovém chromatogramu (TIC). Klávesová zkratka uvedená v prezentaci je Alt+X.

XIC Analyzer následně propojí informace o vybrané chromatografické komponentě, souvisejících MS/MS spektrech, odpovídajících MS1 skenech a vypočteném izotopovém profilu.

Jak interpretovat zobrazení v XIC Analyzeru

XIC Analyzer sdružuje několik typů informací v jediném okně. Příklad s látkou Aminocarb uvedený v prezentaci ukazuje hlavní části tohoto rozhraní.

Související MS/MS spektra

Tabulka vlevo nahoře obsahuje tandemová hmotnostní spektra patřící k vybranému XIC binu.

Mezi zobrazené parametry patří:

• číslo XIC,
• číslo skenu,
• retenční čas,
• navržený molekulový vzorec,
• typ prekurzoru,
• monoisotopické m/z,
• nábojový stav.

Tabulka umožňuje zjistit, kdy bylo každé MS/MS spektrum získáno a zda byla všechna spektra přiřazena ke stejnému prekurzoru a složení.

Informace o chromatografickém píku

Tabulka vlevo dole shrnuje chromatografické píky detekované pro extrahovaný ion.

Dostupné informace zahrnují:

• retenční čas apexu píku,
• integrovanou plochu,
• poměr signálu k šumu,
• procentuální zastoupení pozadí,
• počet skenů,
• čísla skenů zahrnutých do píku,
• vypočtené monoisotopické m/z,
• korelaci,
• skupinu píku.

Zvýrazněná komponenta Aminocarb v prezentaci obsahuje sedm skenů seskupených do jednoho chromatografického píku. Tyto skeny zároveň odpovídají sedmi souvisejícím MS/MS spektrům zobrazeným v horní tabulce.

Plochu píku lze použít pro výpočty relativní abundance, zatímco počet skenů, šířka píku, poměr signálu k šumu a úroveň pozadí poskytují další informace o kvalitě chromatografického signálu.

Pozorované a teoretické izotopové profily

V pravé horní části je zobrazena izotopová distribuce odpovídající vybrané komponentě. Pozorované izotopové píky jsou porovnány s teoretickou izotopovou obálkou a chyby hmotnosti jsou uvedeny v ppm.

Toto porovnání představuje jednu z hlavních výhod postupu založeného na XIC. Namísto vyhodnocení izotopové distribuce pouze v jediném MS1 skenu může software využít informace vztahující se k celé chromatografické komponentě.

Dobrá shoda mezi naměřeným a teoretickým profilem podporuje navrženou identifikaci. Nesoulad může znamenat výběr nesprávného monoisotopického iontu nebo přítomnost interferencí v chromatografickém signálu.

Extrahované iontové chromatogramy

V pravé dolní části jsou zobrazeny extrahované iontové chromatogramy odpovídající jednotlivým izotopovým signálům. Zobrazení může zahrnovat aktuální MS1 sken, vybraný rozsah píku, jednotlivé izotopové chromatogramy i jejich součet.

Tento pohled pomáhá ověřit, zda intenzity jednotlivých izotopových iontů společně rostou a klesají v průběhu chromatografického píku. Izotopy pocházející ze stejné sloučeniny by měly mít velmi podobný chromatografický profil.

Nápovědu k XIC Analyzeru lze otevřít přímo v aplikaci nebo klávesou F1.

Potvrzení sloučenin s charakteristickým izotopovým profilem

XIC Analyzer je zvláště užitečný pro sloučeniny obsahující prvky s výrazným izotopovým profilem, například:

• chlor,
• brom,
• síru.

Prezentace tuto možnost demonstruje na imazalilu, sloučenině obsahující chlor. Pozorované izotopové píky velmi dobře odpovídají teoretickému profilu a hodnota Iso.Profile se blíží jedné.

U sloučenin s charakteristickou izotopovou distribucí poskytuje tento údaj další úroveň jistoty nad rámec samotného skóre knihovního vyhledávání MS/MS spektra. Dobrá shoda v knihovně společně s odpovídajícím chromatografickým píkem a správným izotopovým profilem představuje přesvědčivější důkaz než kterýkoli z těchto parametrů samostatně.

Praktický postup pro kontrolu XIC

Následující postup shrnuje, jak lze nástroje představené v materiálu využít při rutinním vyhodnocování LC–MS/MS dat.

1. Zobrazte klíčové vlastnosti XIC

Do tabulky výsledků přidejte položky XIC Number, nSpec, Iso.Profile a Width. Tyto parametry usnadňují rozlišení jednotlivých spekter od chromatografických komponent a pomáhají identifikovat výsledky vyžadující podrobnější kontrolu.

2. Začněte s vypnutou funkcí Best Hits

Prohlédněte všechna MS/MS spektra přiřazená ke každému XIC binu. Ověřte, zda je knihovní identifikace konzistentní v celé šířce chromatografického píku a zda některé spektrum nedosahuje výrazně vyššího skóre než ostatní.

3. Zkontrolujte reprezentativní výsledek

Po vyhodnocení kompletní sady zapněte Best Hits, pokud potřebujete jednodušší seznam na úrovni jednotlivých komponent. Zachováno bude spektrum s nejvyšším skóre z každého XIC binu.

4. Odešlete důležité kandidáty do XIC Analyzeru

Klikněte pravým tlačítkem na položku v tabulce nebo odpovídající komponentu v chromatogramu a zvolte Send To → XIC Analyzer.

5. Zkontrolujte kompletní chromatografický kontext

Vyhodnoťte čísla skenů, apex píku, integrovanou plochu, poměr signálu k šumu, pozadí, šířku píku a počet skenů. Ověřte, že signál skutečně odpovídá chromatografické komponentě a nikoli pouze izolovanému skenu.

6. Vyhodnoťte izotopový profil

Porovnejte pozorovanou izotopovou distribuci s teoretickou obálkou. Tento krok je zvláště důležitý u sloučenin obsahujících chlor, brom, síru nebo jiné prvky s charakteristickými izotopovými profily.

7. Posuďte všechny důkazy společně

Společně zvažte skóre knihovního vyhledávání, chybu hmotnosti prekurzoru, retenční chování, kvalitu píku, shodu izotopového profilu a konzistenci souvisejících MS/MS spekter.

8. Před filtrováním prověřte výsledky XIC = 0

Nepředpokládejte automaticky, že záznam s XIC Number = 0 není relevantní. Tyto signály zkontrolujte samostatně ještě před použitím filtru pozadí, který by je mohl odstranit.

Řešení problémů s výsledky XIC = 0

Závěrečná část prezentace se zabývá důležitým omezením souvisejícím s filtrováním pozadí a výsledky označenými XIC = 0.

U několika souborů analyzovaných autorem odstranilo nastavení numerického limitu pozadí – dokonce i relativně vysoké hodnoty – některé potenciálně zajímavé píky. Pokud bylo nastavení pozadí ponecháno na hodnotě Any, tyto signály zůstaly viditelné.

Výsledky s XIC = 0 obvykle vykazovaly následující vlastnosti:

• nSpec = 1,
• Iso.Profile = 0,
• Width = 0,
• Background = 0,
• pouze jeden související sken.

Protože tyto události netvoří měřitelný chromatografický pík rozložený přes více skenů, nesplňují kritéria požadovaná XIC Analyzerem. Možnost odeslat je do analyzátoru proto není dostupná.

Tyto záznamy však mohou přesto vykazovat:

• vysokou relativní abundanci,
• vysoké skóre knihovního vyhledávání,
• potenciálně relevantní navrženou identifikaci.

Příklad z prezentace zahrnuje výsledek s XIC = 0, relativní abundancí 100 a dobrým skóre vyhledávání. Automatické odstranění všech takových signálů by proto mohlo vést ke ztrátě důležitých informací.

Doporučená kontrola signálů XIC = 0

Před použitím nenulového filtru pozadí prezentace doporučuje izolovat a ručně zkontrolovat všechny výsledky s XIC = 0.

Nejprve vyberte všechny záznamy s XIC Number 0 a seřaďte je podle abundance tak, aby byly nejintenzivnější signály nahoře. Pomocí šipek na klávesnici postupně procházejte jednotlivé záznamy a u každé navržené identifikace kontrolujte butterfly plot.

Při kontrole zvažte zejména:

• kvalitu knihovní shody,
• ostatní komponenty přítomné ve vzorku,
• historii a očekávané složení vzorku,
• možnost, že spektrum představuje interferenci,
• zda akviziční metoda nemohla vytvořit izolovanou MS/MS událost,
• zda je přiřazení prekurzoru smysluplné.

Výsledek lze rovněž znovu odeslat do Library Search a prověřit alternativní kandidáty. Pokud je nutné další potvrzení, data lze zpracovat v původním softwaru výrobce přístroje a následně importovat do NIST Search.

Nenulový filtr pozadí by měl být použit až po kontrole těchto signálů. Je důležité mít na paměti, že jejich odfiltrováním se zároveň odstraní jejich příspěvek do výpočtů abundance.

Proč může signál získat XIC = 0?

Podle prezentace jsou tyto signály obvykle spojeny pouze s jedním skenem, a mají proto nulovou chromatografickou šířku. Software z nich nemůže vytvořit standardní extrahovaný iontový chromatogram.

Takové chování může naznačovat, že některý parametr akvizice nebyl pro danou analýzu nastaven optimálně. Software těmto záznamům přiřadí XIC Number 0 a může je seskupit dohromady i v případě, že pocházejí z různých prekurzorových iontů.

Materiál nestanovuje žádné univerzální hodnoty pro akviziční parametry, toleranci hmotnosti, retenčního času ani pozadí. Tyto hodnoty vždy závisí na konkrétní datové sadě a analytické metodě. Příklady místo toho zdůrazňují význam porozumění tomu, jak zvolená nastavení ovlivňují, které výsledky zůstanou zachovány a které budou odstraněny.

Hlavní závěry

Extrahovaný iontový chromatogram by neměl být vnímán pouze jako chromatografická stopa používaná pro výpočet plochy píku. Ve postupu LC–MS/MS založeném na XIC propojuje navrženou knihovní identifikaci s odpovídajícími chromatografickými a MS1 daty.

Mezi nejdůležitější praktická doporučení patří:

• Pro hodnocení identifikace používejte celý chromatografický pík.
• Před výběrem spektra s nejvyšším skóre zkontrolujte všechna MS/MS spektra v daném XIC binu.
• Při vyhodnocování dat zobrazujte parametry XIC Number, nSpec, Iso.Profile a Width.
• Pomocí XIC Analyzeru kontrolujte seskupení skenů, plochu píku, pozadí, izotopové profily a chromatografické zarovnání.
• Zvláštní pozornost věnujte sloučeninám obsahujícím chlor, brom nebo síru.
• Před použitím filtrů pozadí zkontrolujte výsledky XIC = 0.
• Nedovolte, aby nastavení filtrů bez předchozí kontroly odstranilo potenciálně významné signály s vysokou abundancí nebo vysokým skóre.

Kombinace vyhledávání ve spektrálních knihovnách s chromatografickým kontextem a validací izotopového profilu poskytuje u LC–MS/MS komplexnější základ pro identifikaci i kvantifikaci.