Vyhledávání fragmentů v okně Chromatogram v NIST26

Fragmentace ve zdroji může komplikovat interpretaci LC-MS/MS dat, protože k fragmentaci iontů může docházet ještě před jejich vstupem do kolizní cely. Namísto čistého spektra vytvořeného z izolovaného prekurzorového iontu tak může analytik získat směs obsahující protonovanou molekulu, aduktové ionty a fragmenty vzniklé přímo v iontovém zdroji.

NIST26 nabízí nástroje pro rozpoznávání těchto spekter a jejich vyhledávání v MS/MS knihovnách. Postup popsaný Jamesem Littlem z Mass Spec Interpretation Services ukazuje, jak lze kombinovat výsledky vyhledávání v chromatogramu, filtrovaná a nefiltrovaná skóre a okno NIST Library Search pro identifikaci sloučenin i v případech, kdy je molekulový ion slabý nebo zcela chybí.

👉Stáhněte si PDF příručku ZDE

Co je fragmentace ve zdroji?

K fragmentaci ve zdroji dochází tehdy, když se ionty analytu fragmentují přímo v iontovém zdroji ještě před vlastní tandemovou hmotnostní spektrometrií. Typické spektrum fragmentace ve zdroji proto obsahuje směs prekurzorových a fragmentových iontů.

Například protonovaná molekula [M+H]⁺ může zůstat ve spektru viditelná současně s několika fragmentovými ionty. To představuje zásadní rozdíl oproti běžnému experimentu MS/MS, při kterém je konkrétní prekurzor nejprve izolován a následně fragmentován, čímž vzniká relativně čisté spektrum produktových iontů.

Pro tyto ionty se používají například následující termíny:

• fragmentové ionty vznikající ve zdroji (in-source fragment ions)
• fragmenty indukované ve zdroji (source-induced fragments)
• produkty fragmentace ve zdroji (in-source fragmentation products)
• fragmentové ionty ze zdroje (source fragmentation ions)
• produkty CID vznikající ve zdroji (in-source CID products)

Prezentace doporučuje jako nejpřesnější a nejjednoznačnější označení termín „in-source fragment ions“, tedy fragmentové ionty vznikající ve zdroji.

Proč je fragmentace ve zdroji důležitá při vyhledávání v knihovnách?

Při přímém zavádění referenčního standardu během tvorby knihovních dat NIST lze získávat MS2 spektra nejen pro adukty molekulových iontů, ale také pro fragmentové ionty pozorované ve vysokém rozlišení.

To je obzvláště důležité u sloučenin, jejichž intaktní protonovaná molekula vykazuje velmi nízkou intenzitu nebo ve spektru prakticky chybí. Pokud by bylo vyhledávání omezeno výhradně na [M+H]⁺, mohlo by dojít ke ztrátě užitečné knihovní shody, přestože jsou ve spektru přítomny intenzivní a charakteristické fragmentové ionty.

Spektrum uvedené na straně 3 prezentace tento princip dobře ilustruje: ve stejném spektru jsou přítomny fragmentové ionty s m/z 311 a 333 společně s [M+H]⁺ při m/z 377, [M+Na]⁺ při m/z 399 a [M+K]⁺ při m/z 415.

Cholesterol: když protonovaná molekula nestačí

Užitečným příkladem je cholesterol. Při elektrosprejové ionizaci v pozitivním módu není u iontu [M+H]⁺ cholesterolu pozorována prakticky žádná významná intenzita. Namísto toho dochází ke ztrátě vody a vzniká intenzivní dehydratovaný ion.

Významné MS/MS spektrum cholesterolu v knihovně NIST je proto založeno na iontu [M+H−H₂O]⁺ při m/z 369,3506, nikoli na intaktním prekurzoru [M+H]⁺.

Tento příklad ilustruje důležitý princip: užitečné knihovní MS/MS spektrum nemusí nutně pocházet z intaktní protonované molekuly. Stabilní a intenzivní ionty vznikající předvídatelnou fragmentací ve zdroji mohou rovněž poskytovat cenné informace pro identifikaci sloučenin.

Jak NIST26 pracuje s malými neutrálními ztrátami?

V případě relativně malých ztrát dokáže NIST26 výsledný iont přiřadit ke správné molekulové struktuře přímo v okně Chromatogram.

To se týká například:

• H₂O
• NH₃
• dalších malých neutrálních molekul
• tvorby aduktů, například [M+Na]⁺

Například u cholesterolu tak může být výsledek chromatografického vyhledávání pro [M+H−H₂O]⁺ stále zobrazen společně se správnou strukturou cholesterolu.

Prezentace uvádí jako další příklad oxosorbicillinol. Jeho výsledek v chromatogramu je přiřazen k typu prekurzoru [M+H−H₂O]⁺, přičemž je zachována identita a struktura oxosorbicillinolu.

Co se děje při větších ztrátách fragmentů?

Situace je složitější v případech, kdy fragmentace zahrnuje větší ztrátu hmotnosti.

U velkých ztrát fragmentů se správná struktura původní molekuly nezobrazuje přímo u příslušné položky v seznamu výsledků okna Chromatogram. Struktury se zde zobrazují především pro běžné molekulové a aduktové ionty, jako jsou M+H a M+Na, a pro výše uvedené malé neutrální ztráty.

Pro podrobnější analýzu větších fragmentů vzniklých ve zdroji a získání navrhovaných struktur je proto nutné přenést spektrum do okna NIST Library Search.

Využití Score a Score (Unfiltered) pro vyhledávání kandidátů

Užitečnou strategií pro rozpoznání možných spekter fragmentace ve zdroji je porovnání standardního parametru Score s hodnotou Score (Unfiltered).

Prezentace doporučuje přidat Score (Unfiltered) mezi zobrazované parametry ve spodní části okna Chromatogram a ve filtru nastavit dostatečně vysokou hodnotu, například >800. Výsledky lze následně seřadit podle Score (Unfiltered), takže se kandidáti s nejvyššími hodnotami zobrazí na začátku seznamu.

Zvláštní pozornost je vhodné věnovat položkám, u nichž platí:

Score je výrazně nižší než Score (Unfiltered).

Velký rozdíl mezi oběma hodnotami může upozornit na potenciálně užitečné spektrum fragmentace ve zdroji, které si zaslouží další analýzu.

Příklad uvedený v prezentaci je obzvláště výrazný:

• Score: 22
• Score (Unfiltered): 928

Navzdory extrémně nízké standardní hodnotě Score naznačuje velmi vysoké nefiltrované skóre, že spektrum obsahuje potenciálně cenné informace, které lze dále analyzovat pomocí samostatného knihovního vyhledávání.

Vyhledávání kandidátů fragmentace ve zdroji v chromatogramu

NIST26 nabízí také vizuální způsob, jak potenciální kandidáty rozpoznat.

Možná spektra fragmentace ve zdroji jsou v TIC chromatogramu označena modrými body. Po výběru některého z těchto kandidátů myší se jeho označení změní z modré na zelenou, což indikuje právě aktivní spektrum propojené s odpovídající položkou v seznamu výsledků.

Analytik tak může vizuálně procházet chromatogram a současně kontrolovat jednotlivá kandidátní spektra a jejich příslušná skóre. Příklad TIC na stranách 7–8 prezentace ukazuje, jak jsou potenciální spektra fragmentace ve zdroji rozmístěna v průběhu chromatografické analýzy.

Jak odeslat spektrum fragmentace ve zdroji do Library Search?

Po nalezení vhodného kandidáta je další postup jednoduchý:

1. V okně Chromatogram identifikujte potenciální spektrum fragmentace ve zdroji.
2. Zkontrolujte jeho hodnoty Score a Score (Unfiltered).
3. Vyberte kandidáta v chromatogramu.
4. Klikněte pravým tlačítkem myši na odpovídající položku.
5. Zvolte Library Search.
6. Prohlédněte získané kandidáty v okně NIST Library Search.

Odeslání spektra do Library Search je zvláště důležité v případě větších ztrát fragmentů, protože v těchto případech nelze vhodné struktury získat přímo ze seznamu výsledků v okně Chromatogram.

Interpretace výsledků Library Search

Po přenesení spektra fragmentace ve zdroji do Library Search může vyhledávání vrátit několik potenciálních identit s vysokými hodnotami skóre.

Příklad na straně 9 to názorně demonstruje. Vyhledávání spektra fragmentace ve zdroji poskytuje několik kandidátních spekter s vysokým skóre, přičemž nejlepší výsledek dosahuje hodnoty 928. Může se přitom zobrazit více knihovních spekter souvisejících kandidátních sloučenin, protože kompatibilní spektrální profily mohou vznikat z různých typů prekurzorů, při různých kolizních energiích nebo různými fragmentačními mechanismy.

Cílem vyhledávání tedy není automaticky přijmout první nalezený výsledek. Seznam kandidátů poskytuje struktury a identity, které je následně nutné posoudit v kontextu experimentálních dat.

Kontrola nastavení Library Search

Při práci se spektry fragmentace ve zdroji je důležité správné nastavení vyhledávání.

Prezentace upozorňuje na několik parametrů, které je vhodné před interpretací výsledků zkontrolovat. Vyhledávání je nastaveno na Identity a MS/MS, přičemž hodnota m/z prekurzorového iontu je převzata ze spektra. V prezentovaném příkladu jsou tolerance pro knihovní vyhledávání ve vysokém rozlišení nastaveny na 20 ppm pro prekurzorové ionty a 40 ppm pro produktové ionty.

Dalším důležitým parametrem je MS/MS Hit List Filter. V postupu prezentovaném v materiálu je možnost Enable Filtering (Tandem Only) vypnuta.

Analytici by proto měli před vyhledáváním zkontrolovat nastavení Library Search a nespoléhat pouze na výchozí parametry, protože nevhodné filtrování by mohlo z výsledků odstranit potenciálně užitečné shody.

Praktický postup v NIST26

Pro rutinní vyhledávání potenciální fragmentace ve zdroji v NIST26 doporučuje prezentace následující postup:

1. Prohlédněte TIC v okně Chromatogram a vyhledejte možná spektra fragmentace ve zdroji.
2. Přidejte mezi zobrazované parametry Score (Unfiltered).
3. Nastavte relativně vysokou prahovou hodnotu Score (Unfiltered), přičemž jako vhodný výchozí bod je doporučeno >800.
4. Seřaďte výsledky podle Score (Unfiltered) od nejvyšší hodnoty.
5. Vyhledejte neobvykle velké rozdíly mezi Score a Score (Unfiltered).
6. Vyberte slibné kandidáty označené v TIC.
7. Spektra zahrnující významnější ztráty fragmentů odešlete do NIST Library Search.
8. Zkontrolujte nastavení MS/MS vyhledávání a filtrů.
9. Posuďte kandidáty s vysokým skóre a navrhované struktury.

Tento postup představuje praktický způsob, jak získat identifikační informace ze spekter, která by jinak mohla působit problematicky, protože jejich dominantním iontem je fragment vzniklý ve zdroji namísto očekávaného aduktu molekulového iontu.

Závěr

Fragmentace ve zdroji nemusí nutně znamenat, že je LC-MS spektrum pro identifikaci nepoužitelné. V některých případech, zejména u sloučenin, jako je cholesterol, může být fragment vznikající ještě před konvenční MS/MS analýzou ve skutečnosti dominantním a analyticky velmi užitečným iontem.

NIST26 tento problém řeší kombinací vyhledávání na úrovni chromatogramu s knihovními MS/MS daty ve vysokém rozlišení. Malé neutrální ztráty a běžné adukty lze přímo spojit se strukturou původní molekuly, zatímco rozsáhlejší fragmentaci lze analyzovat přenesením spektra do okna Library Search. Porovnání hodnot Score a Score (Unfiltered) navíc poskytuje praktický nástroj pro rozpoznání slibných kandidátů fragmentace ve zdroji.

Pochopení těchto souvislostí a použití vhodného nastavení vyhledávání umožňuje analytikům získat relevantní kandidátní struktury i ze spekter, která by jinak mohla být při interpretaci LC-MS/MS dat přehlédnuta.